線粒體是細(xì)胞超氧化物的主要生產(chǎn)者。低中等水平的超氧化物的產(chǎn)生對于許多重要細(xì)胞過程的適當(dāng)調(diào)節(jié)至關(guān)重要，這些過程包括基因表達(dá)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌肉對耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的適應(yīng)性。不受控制的線粒體超氧化物的產(chǎn)生會(huì)觸發(fā)細(xì)胞氧化損傷，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)病機(jī)理，包括癌癥，心血管疾病，神經(jīng)退行性疾病和衰老。Cell Meter 熒光法線粒體過氧化物檢測試劑盒使用我們*的超氧化物指示劑來定量活細(xì)胞中的超氧化物水平。MitoROS 580具有活細(xì)胞滲透性，可以快速，選擇性地靶向線粒體中的超氧化物。與超氧化物反應(yīng)時(shí)會(huì)生成紅色熒光。該檢測試劑盒提供了一種靈敏的一步熒光測定法，可在培養(yǎng)一小時(shí)后檢測活細(xì)胞中的線粒體超氧化物。該試劑盒針對流式細(xì)胞儀應(yīng)用進(jìn)行了優(yōu)化。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的Cell Meter 熒光法線粒體過氧化物檢測試劑盒。
適用儀器
| 流式細(xì)胞儀 | |
| Ex: | 488 nm |
| Em： | 575/26 nm |
| 通道: | PE 通道 |
樣品實(shí)驗(yàn)方案
簡要概述
準(zhǔn)備細(xì)胞密度為0.5-1×10 6細(xì)胞/ mL
用測試化合物處理細(xì)胞以誘導(dǎo)超氧化物
將1 µL 500X MitoROS 580加到0.5 mL細(xì)胞懸液中
將細(xì)胞在37°C染色1小時(shí)
使用帶有FL2通道的流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度
溶液配制
儲(chǔ)備溶液配制
1. MitoROS 580儲(chǔ)備溶液（500X）：將100 µL DMSO（組分C）添加到MitoROS 580（組分A）小瓶中，并充分混合以制成500X MitoROS 580儲(chǔ)備溶液。避光。注意：請密閉存放。
實(shí)驗(yàn)步驟
對于每個(gè)樣品，在自備的0.5 mL生長培養(yǎng)基或緩沖液中制備細(xì)胞，密度為5×10 5至1×10 6個(gè)細(xì)胞/ mL。注意：應(yīng)單獨(dú)評估每種細(xì)胞系，以確定超氧化物誘導(dǎo)的細(xì)胞密度。
在分析緩沖液（組分B）或自備的緩沖液（例如PBS）中用25 µL 20X測試化合物處理細(xì)胞以誘導(dǎo)超氧化物。對于對照細(xì)胞（未處理的細(xì)胞），添加相應(yīng)量的化合物緩沖液。
將細(xì)胞在37°C孵育至少30分鐘。注意：將 Jurkat細(xì)胞在37°C下用50 µM抗霉suA（AMA）處理30分鐘以誘導(dǎo)超氧化物。有關(guān)詳細(xì)信息，請參見圖1。
將0.5 µL細(xì)胞懸浮液中加入1 µL 500X MitoROS 580儲(chǔ)備液。
在37°C下孵育1小時(shí)。注意：對于貼壁細(xì)胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在MitoROS 580孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌一次。適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于單個(gè)細(xì)胞的類型和測試使用的化合物。
使用帶有FL2通道的流式細(xì)胞儀（Ex / Em = 488/590 nm）檢測熒光強(qiáng)度。
