ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下，以期給同行帶來一些啟發(fā)，提高試驗質(zhì)量。
操作步驟
可能原因
解決辦法
選擇試劑
選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑，嚴格按照試劑說明書進行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。
加 樣
1.血清或血漿標本分離不好即進行加樣；
2.手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長（特別是室內(nèi)溫度較高時）；
3.加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外。
1.標本為血清：將血液先自然存放1-2小時后，再用3000rmp離心15分鐘；標本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后必須立即顛倒*混合5-10次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內(nèi)檢測，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。
2.加樣后及時放入孵箱。
3.加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。
4.如果采用AT或其他全自動加樣，選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。
5.標本較多時，請分批操作。
孵 育
1.孵育時未貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗*；
2.孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。
1.貼封片或加蓋；
2.按說明步驟嚴格控制操作時間。
洗 板
1.采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。
2.采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足，導(dǎo)致洗板不*；洗板針堵塞，抽吸不*；洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。
3.反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。
1.保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干；
2.合理安排，或多用幾臺洗板機。
顯 色
1. 顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑；
2. 加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。
1. 顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用；
2. 加樣時保持顯色劑不外流；
3.A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。
終 止
加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致假陽性增加。
加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
讀 板
讀板時板底不清潔。
應(yīng)保證酶標板清潔。
全過程
1.整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸;
2.實現(xiàn)ELISA檢測標準自動化，有效提高檢測質(zhì)量。
在實際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須嚴格按照操作步驟進行操作，同時作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評，以嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測每一份標本，才能保證檢測質(zhì)量?，F(xiàn)在國內(nèi)已有相當(dāng)數(shù)量的單位擁有全自動酶標儀，這對于實現(xiàn)ELISA標準化檢測、提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。
ELISA技術(shù)講座一-抗原與抗體的反應(yīng)
1.2 抗體
1.2.1 抗體的結(jié)構(gòu)
抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。IgG的結(jié)構(gòu)見圖。
① 木瓜酶裂解部位 ② *裂解部位
重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合（見圖），是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）。每個Fab都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個抗原結(jié)合位點，是單價的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG*的抗原性。
IgG可被*分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F（ab'）2，能和兩個相同的抗原結(jié)合；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。
IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結(jié)合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。
機體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病*后可持續(xù)數(shù)年之久。
IgM抗體一般為保護性抗體具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。右圖為為甲型肝炎病人血清中IgG抗體和IgM抗體出現(xiàn)的時間和水平。
1.3 抗原抗體反應(yīng)
1.3.1 可逆性
抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：
Ag+Ab→Ag·Ab
抗體的親和力（affinity）是抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以用平衡常數(shù)K表示：
K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]
Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測定中可得到更好的效果。
1.3.2 zui適比例
在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例zui合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）?？贵w過量稱為前帶（prezone），抗原地過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學(xué)方法測定抗原時，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。
1.3.3 特異性
抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），隨來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。
但是這種特異性也不是的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜*（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH中的
α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)達到50mIu/mlhCG）的實際中必須應(yīng)用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。
1.3.4 敏感性
在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。
1.4 免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用
由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定：
1） 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。
2） 激素，包括小分子量的甾體激素等。
3） 抗生素和藥物。
4） 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。
5） 另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗-HBs等。
5． 標記的免疫測定
如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為放射性核素和酶，zui后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標記免疫測定中，一般加入過量的標記試劑以保證與待測物*反應(yīng)。以標記抗體（Ab※）檢測抗原（Ag）為例，反應(yīng)式如下：
Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※
在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標記物與結(jié)合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標記物被固定在載體上，而游離的標記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結(jié)合標記物的測定可在固相上進行。
6． 酶免疫測定
酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相EIA中可不需進行游離的和結(jié)合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA需*行游離的和結(jié)合的標記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年zui初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay），簡稱ELISA，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗的，雖然含義不*確切，但已習(xí)用。
