隨著現(xiàn)代生物學的發(fā)展，細胞群體的研究已不再能滿足我們的需要?？茖W家們開始解析單個細胞的行為。而單細胞技術在zui近幾年也一直被《Nature Methods》雜志列為值得關注的技術。
如今，單細胞基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學研究不再是遙不可及。利用新興的微流體方法和分子生物學技術，研究人員逐漸能從群體噪音中提取單細胞信號?！禛enome Technology》雜志請來了一些專家，來分享他們在單細胞分析上的經(jīng)驗。通過一問一答的形式，希望能為您的研究帶來一點啟發(fā)。
Q1：您的細胞捕獲和裂解方法是哪種？為什么？
Q2：您如何產(chǎn)生適合qPCR的單細胞cDNA文庫？
Q3：在改善單細胞qPCR實驗設計上，您有哪些建議？
Q4：您采取哪些步驟來減少實驗誤差以及噪音？
Q5：您如何定量單細胞qPCR結果？
Q6：您分析時使用哪些生物信息學工具？Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我們zui常用的是熒光活化細胞分選（FACS）。對于可分離的樣品，F(xiàn)ACS在高通量工作中zui方便，并且可輕松整合到我們的流程。我們對特定細胞類型也使用免疫磁性富集，例如，收集循環(huán)中的癌細胞。對于裂解，我們使用自己的CelluLyser或羅氏的Real-Time Ready Cell Lysis試劑盒。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學）
顯微抽取、流式細胞術、激光捕獲顯微切割（LCM）或自動化的微型設備都可用來收集單個細胞。每種方法都各有利弊。目前我正在使用流式細胞儀來收集各種細胞類型。FACS將細胞分選到PCR板上，與RT-qPCR儀器兼容。此外，F(xiàn)ACS可利用特定的細胞標志物實現(xiàn)細胞富集。FACS的通量比LCM要高得多。但FACS的缺點是你無法觀察細胞，確定重要參數(shù)，如細胞形態(tài)。FACS還需要單細胞懸液，因此，細胞的過去無從知道。
為避免RNA損失，我們使用與下游酶學反應兼容的裂解緩沖液，而無需進一步純化。目前市場上有一些裂解液可供選擇：CelluLyser（TATAA生物中心）、Real-Time Ready Cell Lysis（羅氏）、Single Cell-to-CT（Life Technologies）等。我們注意到，不同的細胞類型需要不同的裂解液。我們傾向于使用弱的裂解液—水和非商業(yè)化的緩沖液—以避免對下游反應的抑制。如果需要較強的裂解液，我曾用過CelluLyser和Real-Time Ready Cell Lysis緩沖液，還不錯。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學院）
根據(jù)我們的經(jīng)驗，假陽性是單細胞qPCR中的一個主要問題，特別是原代解離細胞。因此，對于原代解離細胞，我們傾向于通過玻璃移液管來收集細胞質。在處理細胞系時，收集整個細胞通常效果不錯。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學，現(xiàn)在天津大學）
我們在單細胞分離上曾使用過幾種方法，如細胞捕獲、細胞顯微操作等。理想方法是取決于樣品的性質和研究目的。
我們曾成功使用細胞顯微操作儀在顯微鏡下分離單個真核細胞和細菌。單細胞可捕獲并加入預裝有40μL PBS緩沖液的PCR管（0.2 mL）或微管（1.5 mL）中。隨后細胞可利用商業(yè)化的試劑盒（如ZR RNA MicroPrep Kit，Zymo Research）裂解以分離RNA，或裂解后直接開展RT-PCR。顯微操作的缺點在于其通量的確不高。Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我們只通過基于PCR的預擴增。在我們看來，TaqMan PreAmp Master Mix（Life Technologies）是*的試劑盒。正確處理樣品是zui重要的。沒有經(jīng)驗的話，很容易犯錯誤。我們在歐洲提供單細胞圖譜分析服務，包括與Life Technologies合作，通過數(shù)字PCR來準確測定拷貝數(shù)。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學院）
我們對細胞質/細胞裂解液直接開展逆轉錄。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學，現(xiàn)在天津大學）
從單細胞中分離RNA之后，使用適當?shù)哪孓D錄步驟。產(chǎn)生的cDNA通常足以測定單細胞中十幾個高表達的基因。不過，如果要測定更多的基因，需要擴增cDNA。目前文獻中有幾種方法來擴增cDNA，不過它們可能的偏向仍有待進一步評估。
