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主要用途

精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測試劑是一種旨在通過硝基藍(lán)四氮唑染料，受到超氧陰離子O2-的還原，產(chǎn)生不溶性藍(lán)黑色色素沉淀，由分光光度儀比色分析，定量檢測精子細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于動物和人體精子細(xì)胞的活性氧族的檢測?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。其中精子細(xì)胞（spermatozoa）對于活性氧較為敏感：低濃度活性氧可以調(diào)節(jié)正常精子功能、精子獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合等；高濃度活性氧則影響精子細(xì)胞的質(zhì)量和功能，因為精子細(xì)胞質(zhì)膜含有大量不飽和脂肪酸，胞漿含有少量的祛除活性氧的相關(guān)酶蛋白，由此活性氧容易造成精子質(zhì)膜的流動性和DNA完整性受到損害，精子運動能力降低，不能參與受精活動，zui終導(dǎo)致特發(fā)性不育癥（idiopathic infertility）。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，硝基藍(lán)四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），是一種黃色水溶性硝基替代性芳香族四氮唑化合物，與細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子O2-反應(yīng)而被直接還原，產(chǎn)生不溶性甲暨色素，在分光光度儀下（650nm波長），呈現(xiàn)吸光峰值的變化。據(jù)此定量檢測精子細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧族的濃度。

實驗步驟

一、樣品預(yù)處理

1．移取2毫升新鮮收集（1小時內(nèi)）的精液到2毫升錐形離心管
2．放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘
3．放進(jìn)臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
4．小心抽去上清液
5．加入2毫升清理液（Reagent A），混勻精子細(xì)胞顆粒群
6．放進(jìn)臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
7．小心抽去上清液
8．加入適量的清理液（Reagent A）
9．充分混勻后，在血細(xì)胞計數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計數(shù)
10．調(diào)整精子細(xì)胞數(shù)為1 X 107/毫升
11．放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時內(nèi)）

注意事項

1．本產(chǎn)品為100次（96孔板）操作
2．操作時，須戴手套
3．孵育時，須避免光照
4．測試前，精子細(xì)胞須新鮮收集，1小時內(nèi)為適合
5．精子細(xì)胞懸液制備后即刻測讀，不宜過夜保存
6．精子細(xì)胞懸液須清澈
7．如果需要排除精液白細(xì)胞的干擾，建議純化精子細(xì)胞：精子細(xì)胞高純分離試劑盒（14003）
8．如果需要區(qū)分精液各種成分的活性氧生成情況，建議使用精漿（seminal plasma）氧化應(yīng)激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測試劑盒（14007.1）
9．本產(chǎn)品適合凍存的精子細(xì)胞檢測
10．如果活性氧濃度過低，可以延長孵育時間至2小時
11．本公司提供系列精子細(xì)胞分析試劑產(chǎn)品