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組織蛋白激酶A（PKA）活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

組織蛋白激酶A（PKA）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到PKA磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中PKA活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中PKA激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

蛋白激酶A（protein kinase A；PKA），又稱cAMP依賴性蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase），是第二信使依賴性酶。通過影響腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase；AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase）的活性，而決定cAMP水平，達(dá)到調(diào)節(jié)PKA活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞對于各種外部刺激的反應(yīng)，包括細(xì)胞生長、代謝、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂、肌動蛋白細(xì)胞骨架重排等。該全酶（holoenzyme）具有兩個催化亞體和兩個調(diào)節(jié)亞體構(gòu)成的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。cAMP結(jié)合調(diào)節(jié)亞體，而釋放出活化的催化亞體，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白上絲/蘇氨酸（serine/threonine）的磷酸化，諸如CREB、Histone H1、CREM、NF-κB和核受體等，而調(diào)控一系列細(xì)胞活動。其磷酸化目標(biāo)序列為Arg-Arg-X-Ser/Thr或Lys-Arg-X-X- Ser/Thr。蛋白激酶A 至少有兩個亞酶：I型亞酶存在于胞漿內(nèi)，而二型亞酶與細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞骨架相關(guān)。基于底物L(fēng)RRASLG，在ATP的存在下，受到PKA激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析蛋白激酶A的活性。其反應(yīng)方式為：

PKA

LRRASLG  +  ATP  →  LRRApSLG  +  ADP

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD+

          （高吸收峰）（低吸收峰） 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）            60毫升

裂解液（Reagent B）            10毫升

緩沖液（Reagent C）            4毫升

酶促液（Reagent D）          500微升

反應(yīng)液（Reagent E）          500微升

底物液（Reagent F）           500微升

陰性液（Reagent G）          500微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

PKA激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺式離心機：用于細(xì)胞預(yù)處理

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

一、待測樣品準(zhǔn)備

1．手術(shù)取出動物組織，并秤重500毫克組織重量 

2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3．（選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗

4．（選擇步驟）抽去清理液

5．移入到一個液氮凍存管

6．即刻放進(jìn)液氮罐過夜

7．次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8．放進(jìn)一個15毫升錐形離心管

9．加入置于冰槽里的100至500微升裂解液（Reagent B）（注意：可以調(diào)節(jié)蛋白濃度） 

10．強力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11．放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫?/span>

12．即刻放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g 

13．小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

14．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

15．放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、測定準(zhǔn)備

1．準(zhǔn)備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里 

2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

3．緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定

1．移取130微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入20微升酶促液（Reagent D）

3．加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

4．加入20微升底物液（Reagent F）

5．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6．加入10微升陰性液（Reagent G）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

四、樣品測定

1．移取130微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入20微升酶促液（Reagent D）

3．加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

4．加入20微升底物液（Reagent F）

5．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6．加入10微升待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

五、計算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

六、酶標(biāo)板測定

1．在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2．分別移取130微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3．分別加入20微升酶促液（Reagent D）

4．分別加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

5．分別加入20微升底物液（Reagent F）

6．輕輕搖動96孔板

7．在30℃溫度下孵育3分鐘

8．分別加入10微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

9．輕輕搖動96孔板

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11．活性計算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.1（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

七、抑制劑篩選

1．在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、*活性和待測抑制劑樣品

2．按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

內(nèi)容物空背景對照樣本背景*酶活性待測抑制劑酶活性

緩沖液（Reagent C）20微升20微升20微升20微升

陰性液（Reagent G）20微升10微升10微升——

待測抑制劑——10微升――10微升

用戶自備的純化酶————10微升（1毫單位）10微升（1毫單位）

96孔板每孔總量空背景對照孔

（40微升）樣本背景孔

（40微升）*活性孔

（40微升）待測抑制劑樣品孔

（40微升）

輕輕搖動96孔板，混勻，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作

3．分別移取100微升緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里

4．分別加入20微升酶促液（Reagent D）

5．分別加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

6．分別加入20微升底物液（Reagent F） 

7．輕輕搖動96孔板

8．在30℃溫度下孵育3分鐘

9．加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品

10．即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測：測讀30分鐘

11．抑制活性計算：

1)[（*活性讀數(shù)－空背景對照讀數(shù)）－（抑制劑樣品活性讀數(shù)－樣本背景讀數(shù)）]÷（*活性讀數(shù)－空背景對照讀數(shù)）＝實際抑制百分率

2)IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度

X（所需抑制劑樣品濃度）＝（已知抑制劑樣品濃度÷實際抑制百分率）X 50％

3）直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（OD）；橫座標(biāo)（X軸）為已知抑制劑濃度

注意事項

1．本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作

2．操作時，須戴手套

3．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4．樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 

5．樣品須澄清，至關(guān)重要 

6．建議使用比色皿測定

7．加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測定

8．測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘

9．光度測定后，比色皿須清洗*

10．樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11．樣本測定讀數(shù)持續(xù)上升，表明酶活過低或樣品量過低

12．建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1） 

13．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

14．可以使用蛋白激酶A抑制劑（PKA-PKI）作為抑制劑對照或陰性對照

15．蛋白激酶A活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

16．本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感