北京松信宏澤科技有限公司

：潘女士

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四環(huán)素ELISA試劑盒

1 概要

四環(huán)素是一種光譜抗生素，具有殺菌作用。但當(dāng)人體累計攝入量超過一定值，或食入四環(huán)素高殘留量的食物時，會產(chǎn)生毒副作用。嚴(yán)重的能引起牙齒發(fā)黃，四環(huán)素牙，因此，歐洲以及中國都禁止四環(huán)素在家畜飼養(yǎng)中使用。

本試劑盒采用間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，定量或定性檢測蜂蜜、肌肉組織中的四環(huán)素。

2 原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測樣本中的四環(huán)素。在微孔板上包被四環(huán)素檢測抗原，樣本中的四環(huán)素將和酶標(biāo)板上的四環(huán)素檢測抗原競爭結(jié)合四環(huán)素抗體，洗滌后，加入酶標(biāo)二抗結(jié)合與四環(huán)素檢測抗原結(jié)合的四環(huán)素抗體，洗滌后，用TMB底物系統(tǒng)顯色，微孔板吸光值與樣本中四環(huán)素胺含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出四環(huán)素的含量。

3 試劑盒組份

每個試劑盒中的試劑可進(jìn)行96個測量（包括標(biāo)準(zhǔn)測定），試劑盒組份：                                                                                                                  

包被有四環(huán)素檢測抗原的微孔板-----96孔（8孔/條×12條）

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液------------------------------6瓶（1.0 mL/瓶）

分別為0號：0 μg/L；1號：0.5 μg/L；2號：1.5 μg/L；3號：4.5 μg/L；4號：13.5 μg/L；5號：40.5 μg/L；

1ppm高濃度標(biāo)準(zhǔn)品----------------------------------------1瓶（1 mL）

20×濃縮洗滌液-------------------------------------------1瓶（40 mL） 

5×濃縮復(fù)溶液---------------------------------------------1瓶（50 mL）

四環(huán)素抗體溶液---------------------------------------------1瓶（7 mL）

酶標(biāo)二抗溶液----------------------------------------------1瓶（12 mL） 

底物溶液A---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

底物溶液B---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

終止液---------------------------------------------------------1瓶（7 mL）

封板膜-------------------------------------------------------------------3張

說明書-------------------------------------------------------------------1份    

4 另外所需儀器和試劑

4.1試劑

l 0.1 M 氫氧化鈉（分析純）

稱取0.4 g 氫氧化鈉，加超純水溶解后定容至100 mL。

l 1％三氯乙酸（分析純）

稱取1 g三氯乙酸加去離子水混勻定容至100 mL。

l 3％三氯乙酸（分析純）

稱取3 g三氯乙酸加去離子水混勻定容至100 mL。

4.2 儀器

l 微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）

l 天平（精度0.01 g）

l 勻漿器

l 振蕩器

l 離心機(jī)和離心管

l 可調(diào)式20 μL-200 μL 和100 μL-1000 μL微量移液器

四環(huán)素ELISA試劑盒

5 樣品處理

l 1×復(fù)溶液的配制：將5×濃縮復(fù)溶液和蒸餾水按照1：4稀釋混勻待用

5.1 組織、肝臟、雞蛋（蛋清和全蛋）（稀釋倍數(shù)為20倍）

l 稱取2 g （±0.02 g）均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入4 mL 3％三氯乙酸溶液，zui大轉(zhuǎn)速振蕩3 分鐘；

l 4000 rpm離心10 分鐘；

l 取100 μL上清液加入100 μL0.1 M 氫氧化鈉，再加入800 μL1×復(fù)溶液稀釋，混合30 s（如果稀釋后出現(xiàn)渾濁，需要離心，室溫4000r/min以上，離心10min）；

l 取50 μL用于分析。

5.3 蜂蜜樣本（稀釋倍數(shù)為40倍）

l 稱取1 g（±0.02 g）蜂蜜樣品于50 mL離心管中，加入2 mL 3％三氯乙酸溶液，振蕩5 分鐘；

l 4000 rpm離心10分鐘；

l 取100 μL上清液與1.9 mL1×復(fù)溶液混合均勻；

l 取50 μL用于分析。

6 注意事項

l 標(biāo)準(zhǔn)品中含有高濃度的四環(huán)素，請小心使用，避免污染試劑盒以及檢測樣本。

l 嚴(yán)格按照說明書的相應(yīng)說明來保存和使用試劑盒內(nèi)的各種試劑。

l ELISA盡量保持在室溫環(huán)境下操作，以避免因溫度差異帶來的變異；同時避免在通風(fēng)口和陽光直射下操作。

l 確保樣本正確儲存(測試樣本在2~8℃下冷藏盡量不超過1天，其余分裝-20℃凍存)。

l 試劑使用之前應(yīng)充分搖勻，以保證試劑的使用濃度合理。

l 不要使用過期的試劑盒。

l 不同批次的酶標(biāo)記物和抗體，和微孔板不能混用。

l 試劑盒保存于2～8 °C，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2～8 °C存放，底物溶液要避光保存。

l 使用之前，將樣本及所需板條和試劑的溫度平衡至20～25°C，否則可能導(dǎo)致后面檢測吸光值偏低。試劑使用完后應(yīng)立即放回2～8°C冷藏。

l 洗板后出現(xiàn)板孔干燥，會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好，因此洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

l 反應(yīng)終止液為2 M硫酸，應(yīng)避免與皮膚和衣物接觸。

l 底物溶液如果變藍(lán)表示已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。

l 零標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值<0.6時，表示試劑盒已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。

7 檢測步驟

l 編號：將四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品對應(yīng)微孔按序編號，建議每個標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均做重復(fù)孔。

l 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：制備四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：50ul標(biāo)準(zhǔn)濃縮液用450ul稀釋好的復(fù)溶液稀釋并混合均勻，現(xiàn)配 現(xiàn)用。

l 例如：標(biāo)準(zhǔn)品0號：取0號標(biāo)準(zhǔn)品50ul用450 μL 1×復(fù)溶   液稀釋混勻。其余標(biāo)準(zhǔn)品 均按照0號標(biāo)準(zhǔn)品的配制模式來稀釋 

l 1×洗滌液的配制：將20×濃縮洗滌液與蒸餾水按照1;19的比例稀釋混勻待用

l 加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品提取液50 μL，然后每孔分別加入四環(huán)素抗體溶液50 μL。

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于37℃避光靜置30分鐘。

l 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續(xù)洗板4次，每次洗板輕微震蕩10秒左右，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

l 加二抗：每孔加入酶標(biāo)二抗溶液100 μL。

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于37℃避光靜置30分鐘。

l 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續(xù)洗板4次，連續(xù)洗板4次，每次洗板輕微震蕩10秒左右，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

l 顯色：每孔加入底物A液50 μL，再加底物B液50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min；

l 測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，5分鐘內(nèi)測定450 nm處吸光度值。

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