北京松信宏澤科技有限公司

：潘女士

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喹乙醇代謝物ELISA試劑盒

1 概要

喹乙醇 是一類抗毒素，因價格低廉療效佳，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但由于喹乙醇抗菌劑及其代謝物在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳給人類，長期攝入會引起各種疾病，對人體有致癌、致畸胎等副作用。

喹乙醇抗菌劑在生物體內(nèi)很快被代謝，代謝物與蛋白質(zhì)結(jié)合后能穩(wěn)定存留一段時間，所以檢測喹乙醇殘留時通常是檢測其代謝物。

目前普遍利用LC-UV、LC-MS、LC-MS/MS進行MQCA的殘留檢測，相對于高成本的儀器分析，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）可提供經(jīng)濟、簡單、低成本且大量初篩的檢測。本公司研發(fā)的MQCA酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒，經(jīng)衍生，萃取，ELISA分析即可完成檢測。本試劑盒可用于定性、定量檢測組織中MQCA的殘留。

2 原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA法檢測樣品中的MQCA殘留。在微孔板上預(yù)包被抗MQCA抗原，抗體以及酶標二抗競爭結(jié)合微孔板中MQCA抗原以及標準品或樣品中的抗原，洗滌后用H2O2-TMB底物系統(tǒng)顯色，樣品吸光度值與其所含MQCA量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出MQCA含量。

3 試劑盒組份

每個試劑盒中的試劑可進行96個測量（包括標準測定），試劑盒組份：                                                                       

包被有MQCA抗原微孔板--------------------96孔（8孔/條×12條）

MQCA標準品溶液---------------------------------------6瓶（1mL/瓶）

0號：0 μg/L；1號：0.5μg/L；2號：1.5μg/L；3號：4.5 μg/L；4號：13.5 μg/L；5號：40.5μg/L

抗體工作液---------------------------------------------------1瓶（7 mL）

酶標二抗工作液---------------------------------------------1瓶（7 mL）

底物溶液 A--------------------------------------------------1瓶（7 mL）

底物溶液 B--------------------------------------------------1瓶（7 mL）

終止液---------------------------------------------------------1瓶（7 mL）

20×濃縮洗滌------------------------------------------------1瓶（40 mL）

2×濃縮復(fù)溶液----------------------------------------------1瓶（40 mL）

封板膜-------------------------------------------------------------------1張

說明書-------------------------------------------------------------------1份

4 另外所需儀器和試劑

4.1試劑

l 5 M NaOH：準確稱取20 g NaOH（分析純）, 加入去離子水（或蒸餾水）定容至100mL。

l 0.1 M HCl：準確吸取0.86 ml 濃鹽酸，加入去離子水（或蒸餾水），定容至100 ml。

l 2 M硫酸：將濃硫酸與去離子水（或蒸餾水）按照體積比1:8稀釋代用（80 mL水+10 mL濃硫酸）

l 1×復(fù)溶液：取1份 2×復(fù)溶液和去離子水（或蒸餾水）按照體積比1: 1充分混合均勻待用

l 提取液：取100 mL 0.1 M鹽酸，加入2.5 g NaCL,混合均勻，然后取出10 mL混合均勻的溶液與10 mL甲醇混合均勻待用

l 乙酸yi酯（分析純）

l 正己烷（分析純）

4.2儀器

l 微孔板酶標儀（450 nm）

l 恒溫箱（37℃）

l 天平（精度0.01 g）

l 均質(zhì)機

l 振蕩器

l 離心機和離心管

l 水浴鍋

l 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或氮吹儀

l 可調(diào)式0.5 μL～20 μL， 20 μL～200 μL 和100 μL～1000 μL 微量移液器

l 多道移液器

喹乙醇代謝物ELISA試劑盒

5 樣品處理

組織方法一（稀釋倍數(shù)為2倍）

l 取勻質(zhì)的樣品1.0 g（組織肉類應(yīng)確保樣本無明顯的塊狀的組織）于50 mL離心管中，加入8mL乙酸yi酯，再加入1 mL蒸餾水，1 mL 2 M 硫酸，充分震蕩混勻2分鐘

l 室溫（20～25℃）下4000 rpm離心10分鐘，取上清液4 mL于另一只10 mL離心管中。

l 56~60℃環(huán)境下，氮氣吹干 （氮吹時，使用流量為6 L/ min，一般吹20分鐘即可）。

l 加入1mL正己烷，渦旋1分鐘。加入1 mL1×復(fù)溶液渦旋1分鐘，室溫下4000 rpm離心10分鐘。棄上層有機相，取下清液50 μL用于分析。

組織方法二（稀釋倍數(shù)為2倍）

l 取勻質(zhì)的樣品1.0 g（組織肉類應(yīng)確保樣本無明顯的塊狀的組織）于50 mL離心管中，加入4 mL提取液， 充分震蕩混勻5分鐘

l 取上清1 mL加入5~10 μL5 M NaOH 調(diào)節(jié)PH在7.4左右

l 取50 μL用于分析。

6 注意事項

l 乙酸yi酯層一般20分鐘即可吹干，若仍然有有機溶劑殘存，應(yīng)適當延長氮吹時間，盡量去除有機溶劑。

l 由于正己烷對有機類容器，如塑料離心管，有侵蝕作用，吹干乙酸yi酯層步驟應(yīng)盡量使用玻璃試管，或一次性聚苯乙烯或聚丙烯試管，以免侵蝕作用產(chǎn)生的雜質(zhì)影響實驗結(jié)果。

l 由于槍頭和乙酸yi酯有一定的浸潤作用，使得實際吸取量大于要求量，可能會造成添加回收實驗的回收率稍有偏高的現(xiàn)象。因此在吸取時注意吸取量要控制準確。

l 標準品中含有高濃度的MQCA，請小心使用，避免污染試劑盒以及檢測樣本。

l 嚴格按照說明書的相應(yīng)說明來保存和使用試劑盒內(nèi)的各種試劑。

l ELISA盡量保持在室溫環(huán)境下操作，以避免因溫度差異帶來的變異；同時避免在通風(fēng)口和陽光直射下操作。

l 試劑盒試劑稀釋以及樣本提取確保使用蒸餾水或去離子水；有機溶劑在有效期內(nèi)使用，各項指標應(yīng)符合分析純標示。

l 確保樣本正確儲存(測試樣本在2~8℃下冷藏盡量不超過1天，其余分裝-20℃凍存)。

l 試劑使用之前應(yīng)充分混勻，以保證試劑的使用濃度合理。

l 不要使用過期的試劑盒。

l 不同批次的酶標抗原和抗體微孔板不能混用。

l 試劑盒保存于2～8 °C，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2～8 °C存放，底物溶液要避光保存。

l 使用之前，將樣本及所需試劑的溫度平衡至20～25°C，否則可能導(dǎo)致后面檢測吸光值偏低。試劑使用完后應(yīng)立即放回2～8°C冷藏。

l 洗板后出現(xiàn)板孔干燥，會導(dǎo)致標準曲線線性不好，因此洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

l 反應(yīng)終止液為2 M硫酸，應(yīng)避免與皮膚和衣物接觸。

l 底物溶液如果變藍表示已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。

l 零標準品的吸光值<0.6時，表示試劑盒已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。

7 檢測步驟

l 1×洗滌液的配制：將10×洗滌液與去離子水（或蒸餾水）按照體積比1:9比例充分混合均勻待用

l 編號：將MQCA標準品和待測樣品對應(yīng)微孔按序編號，建議每個標準品和待測樣品均做重復(fù)孔。

l 加樣：每孔加入MQCA標品或樣品50 μL，加入50 μL酶標二抗工作液50 μL，再加入50 μL抗體工作液。

l 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后室溫25℃避光反應(yīng)30分鐘。

l 洗滌：小心揭開封板膜，用1×洗滌液每孔250 μL 洗滌微孔板，連續(xù)洗滌4~5次，每次浸泡30 S，用吸水紙拍干。

l 顯色：每孔加入底物溶液A50 μL，再加入底物溶液B50 μL輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后室溫25℃避光反應(yīng)15 min

l 測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，加入終止液后5分鐘內(nèi)測定450 nm處吸光度值。

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