一.基本原理
核酸分子雜交技術(shù)是目前分子生生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)研究中應(yīng)用zui廣泛的技術(shù)之一，是定性、定量和定位檢測兩條來源不同的聚核苷酸鏈上堿基順序同源性的一種手段。DNA分子是高度有序的雙鍵分子。一條鏈的堿基與另一條鏈的堿基以氫鍵配對相連．形成腺嘌呤與胸腺嘧啶(A．T)，*與胞嘧啶（G．C）的特定堿基對；在RNA中則為A與U(*)，G與C配對。
在堿性環(huán)境加熱或加入變性劑的條件下，核酸分子雙鏈之間的氫鍵被破壞，解鏈成兩條單鏈(稱為變性)。此時如果加入已知DNA和RNA。片段（稱為探針)，在一定的離子強(qiáng)度和溫度下，兩條具有互補堿基順序的DNA與相應(yīng)的cDNA或RNA，RNA與相應(yīng)的RNA或cDNA均可形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)(稱為復(fù)性)，這種由互補堿基順序的任何單鏈核酸分子片段形成雙鏈的過程稱為分子雜交(Molecularhybridization)。
核酸分子雜交可分為液相雜交、固相雜交和原位雜交等三種類型。
原位雜交(Hybridizationinsitu)即原位核酸分子雜交。此法zui早(1969)用于細(xì)胞內(nèi)核糖體RNA的定位等研究，現(xiàn)在被廣泛用來進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)特殊核酸序列的定性、定位和定量的研究，被稱為原位雜交組織化學(xué)或原位雜交細(xì)胞化學(xué)(Insituhybridizationcytoehemistry)。它是將重組DNA技術(shù)與組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，在細(xì)胞原位顯示某種特定基因，mRNA及其產(chǎn)物(特異蛋白)的表達(dá)、定位、半定量和變化規(guī)律的一種新技術(shù)。cDNA的制備因所顯示的mRNA的不同而各異，必須借助于重組DNA技術(shù)。mRNA在RNA依賴性DNA聚合酶的作用下，可反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，因此先提取細(xì)胞中已知的特定mRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成與其互補的cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用后插入載體質(zhì)粒DNA內(nèi)。再將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)增cDNA，然后分離純化cDNA，zui后用缺口平移法進(jìn)行同位素或*標(biāo)記，作為探針待用。
寡聚核苷酸是一種短小的單鏈分子，比cDNA更易穿透組織細(xì)胞，并且可按基因片段的核苷酸序列人工合成。因此近年來人們常用它來制備核酸探針。
原位雜交細(xì)胞化學(xué)技術(shù)包括分子探針的制備，用同位素或*等標(biāo)記探針，制作組織切片，預(yù)雜交、雜交，顯色過程和結(jié)果觀察等。
二.試劑和器具
1.試劑
主要試劑有玉米17SrRNA的cDNA，缺口平移試劑盒，硝酸纖維素膜，去離子甲酰胺，焦碳酸二乙酯，鮭精子DNA，純牛血清白蛋白(BSA)，LB培養(yǎng)基，氨芐*，葡聚糖，*，十二烷基硫酸鈉(SDS)，EDTA，*(Bio-dUTP)，金標(biāo)鏈霉親和素，檸檬酸，檸檬酸鈉，氯化鈉，對苯二酚，AgNO3，異丙醇，疏基乙醇(DTT)，*，冰醋酸，酚，氯仿，乙醇等。
2.器具
主要器具有高速離心機(jī)，電泳儀，真空干燥箱，恒溫?fù)u床，超聲波發(fā)生器等。
環(huán)境、器皿的清潔和藥品的純度是該實驗成功的關(guān)鍵。RNA容易被RNA酶水解，而RNA酶非常穩(wěn)定，所以標(biāo)本和藥品及器皿中應(yīng)避免RNA酶的污染。
三.rDNA探針的制備和標(biāo)記
本實驗所用探針是玉米17SrRNA的cDNA，它是以1.5kb的片段插入在PBluescriptⅡSK(一)中MCS的saci位點上。
1.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
(1)將大腸桿菌(E·coli)JM109單菌落接在5mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
(2)以1％的接種量接入50mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600大約為0.3-0.4時倒入離心管，冰浴10min，4000rpm離心10min，收集菌體。
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