人白細胞介素-8(IL-8)酶聯(lián)免疫試劑盒使用說明

本試劑盒適用于以下樣本的測試（黑底字體為適用樣本）：

血清、血漿- 組織勻漿 –腹水 –細胞培養(yǎng)上清

本試劑盒僅供研究，不用于臨床診斷

目錄

1. 實驗原理
2. 試劑盒組成
3. 試劑盒保存
4. 需要而未提供的試劑和器材
5. 樣本前處理
6. 洗板方法
7. 詳細操作程序
8. 操作總結(jié)
9. 性能參數(shù)

1. 實驗原理：本試劑盒采用的是*雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中人白細胞介素-8(IL-8)的水平。向預(yù)先包被了人白細胞介素-8(IL-8)單克隆抗體的酶標孔中加入白細胞介素-8(IL-8)，溫育；溫育后，加入*標記的抗IL-8抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中人白細胞介素-8(IL-8)的濃度呈正相關(guān)。

2.試劑盒組成：

3.試劑盒保存

• 2-8℃下保存6個月，在-20℃下可以保存更長的時間。酶標板為真空包裝，板條可以拆卸，拆開以后如一次不能用完，請放入提供的密封袋中，放入干燥劑，2-8℃保存，在一個月之內(nèi)仍然有效。試劑不能反復(fù)凍融。

4．需要而未提供的試劑和器材

1. 37℃恒溫箱。
2. 標準規(guī)格酶標儀。
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 雙蒸水或超純水
5. 干凈的試管或Eppendof管
6. 吸水紙

5樣本前處理

1. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
   b.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
   c.血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
   d.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
   e.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
   f.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
2. 洗板方法

1. 手工洗板：先洗去酶標孔中的的液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液，輕輕搖晃30秒，然后甩掉，在吸水紙上拍干，重復(fù)4-5次。
2. 洗板機洗板：洗板機洗板比較便捷，但應(yīng)操作熟練后使用。
3. 詳細操作程序

1. 使用前請先將試劑盒在室溫下平衡半小時。
2. 標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：

1. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
2. 加樣：1）空白孔：空白對照孔不加樣品，*標記的抗IL-8抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50μl，*-HRP50μl（標準品中已事先整合好*抗體，故不加）；3)待測樣品孔:加入樣本40μl，然后各加入抗- IL-8抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60分鐘。
3. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
5. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
6. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
7. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。

9.根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。

1. 操作總結(jié)

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，*標記二抗和酶標試劑，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內(nèi)讀OD值

計算

1. 性能參數(shù)

1. 批內(nèi)差：CV＜10%
2. 批間差：CV＜12%
3. 檢測范圍：1ng/L→380ng/L