牛β乳球蛋白(β-Lg)ELISA試劑盒　　

尊敬的客戶，感謝你選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測(cè)牛血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織等中天然和重組的β-Lg濃度。檢測(cè)其他特殊樣本請(qǐng)咨詢本公司。試劑盒僅供科研使用。 使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑盒組分。 如有疑問(wèn)，請(qǐng)武漢新啟迪生物科技有限公司。 您將得到我們的服務(wù)。

本試劑盒采用雙抗體夾心法，雙抗體夾心原理，是基于要測(cè)試的抗原具有二價(jià)以上的特性，能識(shí)別包被抗體，同時(shí)能識(shí)別檢測(cè)抗體，具體過(guò)程如下：

1. 將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)，并用無(wú)關(guān)蛋白封閉空余結(jié)合位點(diǎn)。
2. 加受檢標(biāo)本使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
3. 加*標(biāo)記抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與*標(biāo)記抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的*標(biāo)記抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
4. 加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，使*標(biāo)記抗體與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)記物。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
5. 加入底物顯色，即可計(jì)算標(biāo)本濃度。
6. 注：一個(gè)抗體分子上可以標(biāo)記上若干個(gè)*分子，一個(gè)*分子可以結(jié)合一個(gè)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，從而帶來(lái)了大量的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合到抗體上，比傳統(tǒng)的直接辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體具有更高的敏感性和放大效應(yīng)。

【牛β-Lg酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)原理】

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（ELISA）。預(yù)先包被的抗體為抗牛β-Lg單克隆抗體。檢測(cè)相抗體為多克隆抗體，經(jīng)*（biotin）標(biāo)記。樣品和*標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)因子呈正相關(guān)。

【牛β-Lg酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)原理示意圖】

 *步            第二部

第三步            第四步

【試劑盒組成】

名稱                             96 Tests            48 Tests                     保存條件

1．牛β-Lg抗體包被板條                  8×12                  8×6                            4/-20℃

2．牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品                             2 支（凍干）     1 支（凍干）            4/-20℃

3．濃縮*化牛β-Lg抗體           1支                     1 支                          4/-20℃

4．濃縮酶結(jié)合物(ABC)                     1支                     1 支                        4/-20℃

5. 酶結(jié)合物(ABC)稀釋液           1瓶             1瓶               4/-20℃

6．抗體稀釋液                    1瓶                     1 瓶                          4/-20℃

7．標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液                  1瓶                     1 瓶                          4/-20℃

8．樣品稀釋液　                  1瓶                     1 瓶                          4/-20℃

9．濃縮洗滌液                                  1 瓶（25×）       1 瓶（25×）              4/-20℃

10．顯色劑A                                   1 瓶                   1 瓶 (避光)               4/-20℃

11．顯色劑B                                   1 瓶            1 瓶                    4/-20℃

12．終止液                                      1 瓶            1 瓶                          4/-20℃

13．說(shuō)明書(shū)                                     1 份            1 份                          室溫

【試驗(yàn)所需自備試驗(yàn)設(shè)備和器材】

1. 酶標(biāo)儀(450nm檢測(cè)波長(zhǎng)濾光片，570nm或630nm校正波長(zhǎng)濾光片) 。
2. 洗板機(jī)（可調(diào)注液量，保證每孔350μl洗液而不溢出）。
3. 超凈工作臺(tái)，生物安全柜，通風(fēng)柜。
4. 高精度單道加液器（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
5. 高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl).
6. 37℃恒溫箱。
7. 低溫離心機(jī)。
8. 電冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.
9. 分析天平。
10. 剪刀，鑷子，鉗子等。
11. 漩渦混合儀，低頻振蕩器等。

【試驗(yàn)所需自備試驗(yàn)耗材及試劑】

1. 離心管（容量為1.5ml，5ml等）。
2. 一次性吸頭（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.
3. 純凈水或蒸餾水。
4. 坐標(biāo)紙。
5. 吸水紙。
6. EDTA，*，肝素

【標(biāo)本收集注意事項(xiàng)】

1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。
2. 血清和血漿避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。
3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
4. 標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。 
5. 可根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)) 。
6. 收集標(biāo)本，盡量做到雙份的用量，避免一次實(shí)驗(yàn)失敗，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)本缺失，從而耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。
7. 收集標(biāo)本時(shí)，應(yīng)該做好防護(hù)措施（比如戴手套，口罩，護(hù)目鏡等），認(rèn)為所有標(biāo)本都具有一定的潛在危險(xiǎn)性。
8. 樣本處理應(yīng)該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。

【標(biāo)本處理辦法】

1. 血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過(guò)夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存。
2. 血漿：用EDTA，*，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm離

    心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）

    保存。

1. 組織勻漿：切取組織塊，0.01MPBS中過(guò)洗一次；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存。
3. 尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃3-6個(gè)月）保存。

注：樣品稀釋的一般原則

用戶須查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測(cè)因子的含量，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測(cè)因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測(cè)范圍。樣品的稀釋?xiě)?yīng)有詳細(xì)記錄。

【注意事項(xiàng)】

1. 試劑盒使用前請(qǐng)保存在2-8℃。除復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，其他成分不可凍結(jié)。
2. 濃縮*化牛β-Lg抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置，會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請(qǐng)用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。
3. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液。
4. 測(cè)試過(guò)程中，牛β-Lg凍干標(biāo)準(zhǔn)品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時(shí)候后，會(huì)迅速失活。
5. 操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
6. 配制試劑時(shí)，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y(cè)試結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無(wú)微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板1分鐘，例如做圓周動(dòng)作，使加入孔中的反應(yīng)液混勻。
7. 實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀應(yīng)嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作，并在使用前充分預(yù)熱。
8. 酶免試驗(yàn)中牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作復(fù)孔。
9. 將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中，置2-8℃保存。
10. 顯色液對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
11. 超過(guò)使用有效日期的試劑盒不能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。
12. 試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，波長(zhǎng)應(yīng)該設(shè)置為450nm和630nm.
13. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時(shí)必須注意安全。
14. 各步驟加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校準(zhǔn)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，*使用排槍加樣。
15. 每次試驗(yàn)測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔zui高濃度的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。
16. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
17. 以洗板機(jī)洗板時(shí),每孔注液量不應(yīng)少于350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時(shí), 用帶紙屑的吸水材料應(yīng)慎重, 防止外源性過(guò)氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應(yīng)。
18. 用終止液終止反應(yīng)后，請(qǐng)于10分鐘內(nèi)讀取OD值。
19. 進(jìn)行復(fù)孔實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果計(jì)算一定要求平均值。
20. 標(biāo)本溶血可能會(huì)有假陽(yáng)性結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
21. 試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該將加過(guò)樣品的板條放于密閉盒內(nèi)，并保持濕度約60%左右。
22. 為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準(zhǔn)。以確保實(shí)驗(yàn)溫度保持恒定。
23. 48T的試劑盒，所有組分均為96T的50%的量。
24. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

【檢測(cè)前準(zhǔn)備工作】

1. 請(qǐng)?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進(jìn)行試驗(yàn)。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 。

3. 牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.0ml至凍干牛β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為10 ng/ml)，之后在管身標(biāo)注①，然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度：10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 ng/ml)。 注意：務(wù)必要保證凍干標(biāo)準(zhǔn)品*溶解和混勻。

4. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例： 取7支潔凈的試劑管，分別標(biāo)注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧.  每管加入300μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。從第①管內(nèi)取出300μl加入到第②管，混勻后，再?gòu)牡?/span>②管取出300μl加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為陰性對(duì)照使用。