人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書

l  本試劑盒用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)的含量。

l  有效期：6個(gè)月

l  保存條件：2-8℃

使用目的

本試劑盒用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)水平。用純化的人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)，再與HRP標(biāo)記的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)濃度。

注意事項(xiàng)

• 本試劑盒僅用于科研，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。
• 使用試劑盒前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書，以試劑盒內(nèi)的說明書為準(zhǔn)，請(qǐng)務(wù)必理解說明書內(nèi)容。
• 酶標(biāo)包被板屬于可拆型，開封后如未用完，板條應(yīng)裝入鋁箔袋密封并2-8°C保存。
• 加樣樣本和試劑應(yīng)盡快完成。
• 避免實(shí)驗(yàn)過程中酶標(biāo)板干燥；清洗后盡快加試劑。
• 實(shí)驗(yàn)開始，所有試劑應(yīng)平衡到室溫 (21-26°C) 后方可進(jìn)行。溫度會(huì)影響吸光度值，但不影響樣本值。
• 切忌用口加樣，以免試劑和樣本粘到皮膚和粘膜上。
• 不要在處理樣本或試劑的區(qū)域抽煙、吃東西、喝酒或化妝。
• 操作時(shí)帶一次性手套，微生物的污染會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。
• 操作應(yīng)按照國(guó)家規(guī)定的安全條列進(jìn)行。
• 過期的試劑盒切勿再使用。
• TMB 底物對(duì)皮膚有刺激性，不慎入眼，立即用大量水沖洗，皮膚上不慎接觸到也應(yīng)立即用肥皂，并用大量的水沖洗。試驗(yàn)中被污染的物品在下次使用前應(yīng)盡快清洗。

試劑盒組成

1.說明書                             1份

2.封板膜                             2張

3.酶標(biāo)包被板                       12孔×8條

4.標(biāo)準(zhǔn) 8ng/ml                 0.6ml×1 瓶

5.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液                     2ml×1 瓶

6.*標(biāo)記的抗TIMP-2抗體        1.5ml×1瓶

7.顯色劑A液                       6ml×1瓶

8.顯色劑B液                       6ml×1瓶

9.終止液                         6ml×1瓶

10.酶標(biāo)試劑                      6ml×1瓶

11. 30倍濃縮洗滌液               20ml×1瓶

需要而未提供的試劑和器材

• 吸光度值在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的酶標(biāo)儀。
• 1-2ml的加樣器。
• 100 ml和1L的量筒。

l  吸水紙。

l  37°C 恒溫箱。

l  蒸餾水或去離子水。

l  數(shù)據(jù)分析和繪圖軟件，圖紙。

l  標(biāo)準(zhǔn)和樣品稀釋的試管。

儲(chǔ)存條件

u  有效期內(nèi)的試劑如開封后未用完，請(qǐng)2-8°C 保存。

u  過期的試劑請(qǐng)不要用，打開后的試劑2-8°C 保存。

u  酶標(biāo)包被板必須2-8°C 保存，如有未用完的酶標(biāo)包被板，打開的鋁箔袋須密封并2-8°C 保存。

u  開封后的試劑盒2-8°C只能保存8周。

試劑準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

樣本處理及要求

1.       血清-用*收集血液，室溫血液自然凝固30分鐘，1000 xg離心15分鐘左右，收集上清，盡早進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存。

2.       血漿-收集好的血漿根據(jù)要求選擇EDTA或者肝素作為抗凝劑，2-8°C 1000 xg離心15分鐘左右，30分鐘內(nèi)收集好，-20°C 或 -80°C 保存，避免反復(fù)凍融。

3.       細(xì)胞上清及相關(guān)液體-收集好的樣本離心后應(yīng)盡快實(shí)驗(yàn)，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存，避免反復(fù)凍融。

操作步驟

u  注意事項(xiàng)

• 所有試劑和樣本使用前必須在室溫下平衡，混勻試劑時(shí)不應(yīng)起泡沫。
• 一旦實(shí)驗(yàn)開始，各操作步驟都應(yīng)盡快完成。
• 避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管，以免交叉污染。
• 一般情況，酶的反應(yīng)與時(shí)間和溫度成正比。

u  操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備小試管6只，依次編好號(hào)碼，先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100ul，然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul加入一只已編好號(hào)的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100ul，棄掉。第六只試管作為0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后各管濃度分別是：4ng/ml,2ng/ml,1ng/ml,0.5ng/ml,0.25ng/ml,0 ng/ml。

在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50ul（建議每個(gè)濃度做2個(gè)平行孔）。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品、酶標(biāo)試劑及*標(biāo)記的抗TIMP-2抗體，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品40μl，然后再加*標(biāo)記的抗TIMP-2抗體10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
2. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
3. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
5. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
6. 溫育：操作同3。
7. 洗滌：操作同5。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
9. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
10. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，即為樣品的實(shí)際濃度。