研究目的

轉(zhuǎn)錄組是指在一個(gè)生物體中所有基因表達(dá)后產(chǎn)物的總和，是功能基因組研究的一個(gè)重要功能指標(biāo)。基于新一代測(cè)序的動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可以在RNA水平研究動(dòng)植物性狀、組織特異性的生理學(xué)過程，了解動(dòng)植物的發(fā)育過程中的分子機(jī)制以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)和進(jìn)化的機(jī)制，并為動(dòng)植物疾病預(yù)防或遺傳育種的分子標(biāo)記開發(fā)提供理論依據(jù)。

研究對(duì)象

動(dòng)植物不同發(fā)育階段、不同物種或相同物種的不同組織器官、不同外界環(huán)境刺激或不同生理狀況的動(dòng)植物的轉(zhuǎn)錄組差異檢測(cè)與分析。

新一代測(cè)序方案
lncRNA-seq（ 長(zhǎng)非編碼RNA 測(cè)序）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA分子，長(zhǎng)度在200nt以上，起初被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。zui近幾年的研究表明lncRNA具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以與蛋白質(zhì)、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和抑制、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及作為miRNA的誘導(dǎo)分子干擾基因的表達(dá)等， 因此lncRNA是一片非常廣闊的未知領(lǐng)域，具有*的研究?jī)r(jià)值和意義。通過rRNA去除的方法，富集lncRNA和mRNA建庫(kù)測(cè)序，可分析lncRNA和mRNA的表達(dá)情況，并發(fā)現(xiàn)大量新lncRNA及mRNA。
*數(shù)據(jù)量：10G
polyA-seq （mRNA測(cè)序）

通過polyA尾抓取mRNA建庫(kù)測(cè)序，檢測(cè)mRNA的差異表達(dá)或結(jié)構(gòu)變異，篩選與疾病或性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可揭示轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性，確定基因以及轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、可變剪接、RNA編輯、帶polyA尾的非編碼RNA和新轉(zhuǎn)錄本。
*數(shù)據(jù)量：5G
基因表達(dá)譜測(cè)序(升級(jí)版DGE)

采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）建庫(kù)，直接對(duì)某一物種或特定細(xì)胞在特定功能狀態(tài)下產(chǎn)生的mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、疾病機(jī)理、生物標(biāo)記和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。相對(duì)而言DGE更適合用于比較基因表達(dá)，無偏性，對(duì)于細(xì)胞生物的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜更為敏感和準(zhǔn)確。RNA-seq和DGE兩種方法結(jié)合，對(duì)于無參考基因組或基因組較大且復(fù)雜的物種，可以有效地發(fā)掘新的功能基因。
*數(shù)據(jù)量：10M reads
Small RNA-seq （小RNA測(cè)序）

Small RNA是生物體內(nèi)一類重要的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度20-30個(gè)核苷酸，主要包含miRNA、 piRNA、siRNA、snoRNA等RNA分子。Small RNA參與基因表達(dá)與調(diào)控、RNA的加工與剪切、蛋白質(zhì)翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發(fā)生等生物學(xué)過程。

微小RNA(microRNA, 簡(jiǎn)稱miRNA)，是small RNA中的主要成分, 在進(jìn)化上高度保守, 可通過識(shí)別靶mRNA 實(shí)現(xiàn)

轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。piRNA(PIWI-interacting RNA)是一類新型的非編碼小分子RNA，與PIWI蛋白相互作用，長(zhǎng)度約26～32個(gè)核苷酸，其作用與Dicer酶無關(guān)。piRNA在生殖細(xì)胞的發(fā)育、轉(zhuǎn)座子沉默、減數(shù)分裂和精子發(fā)生等過程中具有多種生物學(xué)功能，另外piRNA還能通過調(diào)控編碼蛋白基因的甲基化修飾影響神經(jīng)細(xì)胞的記憶功能。如果piRNA研究趨勢(shì)與microRNAs相似的話，那么可以預(yù)見piRNA無疑將一輪新的研究熱潮。
*數(shù)據(jù)量：10M reads

案例解讀

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究胚胎發(fā)育過程lncRNA的作用(Andrea Pauli et al., Genome Research. 2012)

背景：lncRNA是指長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。lncRNA能夠與修飾組蛋白的蛋白復(fù)合體相互作用并影響其活性，從而控制基因的活化狀態(tài)（可激活、激活或抑制），是胚胎發(fā)育過程*的調(diào)節(jié)子。本文系統(tǒng)報(bào)道了脊椎動(dòng)物胚胎的lncRNA表達(dá)圖譜，為以后的遺傳學(xué)、基因組學(xué)和進(jìn)化研究提供了基礎(chǔ)。

選材：研究者以野生型斑馬魚胚胎為研究對(duì)象，在受精后的不同時(shí)期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分別收集1000個(gè)胚胎（見圖2），為了消除差異，樣品在10分鐘之內(nèi)完成收集。

    選材：研究者以野生型斑馬魚胚胎為研究對(duì)象，在受精后的不同時(shí)期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分別收集1000個(gè)胚胎（見圖2），為了消除差異，樣品在10分鐘之內(nèi)完成收集。測(cè)序方法：采用polyA尾富集的方法進(jìn)行RNA測(cè)序，平均測(cè)序數(shù)據(jù)量為200-300M reads，鑒定了胚胎發(fā)育過程中相關(guān)的lncRNA和mRNA。

結(jié)果：獲得斑馬魚不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的lncRNA表達(dá)圖譜

1. 斑馬魚不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)育圖譜

圖2. 斑馬魚發(fā)育取樣時(shí)期。

2. 斑馬魚lncRNA功能分析

對(duì)鑒定的835個(gè)lncRNA基因座和mRNA進(jìn)行共表達(dá)分析，共表達(dá)結(jié)果進(jìn)行GO分析，zui重要的10個(gè)GO中，主要與信號(hào)通路（簇2）、發(fā)育（簇6）和細(xì)胞周期（簇8）相關(guān)，簇4-7幾乎都與發(fā)育功能相關(guān)，說明胚胎中的lncRNA可能發(fā)揮發(fā)育調(diào)控的作用，見圖3。對(duì)幾個(gè)重要的lncRNA進(jìn)行原位雜交驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)不同的lncRNA在不同的發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，在二細(xì)胞期、肌肉和神經(jīng)組織中都有特異性表達(dá)，見圖4。

圖3. lncRNA與mRNA共表達(dá)分析，行表示lncRNA，列表是功能基因，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，白色表示不相關(guān)。

圖4. lncRNA組織特異性原位雜交，對(duì)GO分析中重要的lncRNA進(jìn)行原位雜交，顯示相應(yīng)lncRNA在二細(xì)胞期、肌肉和神經(jīng)組織的特異性表達(dá)。