研究目的

        DNA甲基化是表觀遺傳學研究的重點，是基因調控的手段之一，在維持細胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生等方面起著至關重要的作用?；诓煌男乱淮鷾y序研究方案，檢測表觀遺傳學變異尤其是基因組的甲基化，探討甲基化對于生物學功能的影響，并篩選可應用作為疾病早期診斷、分級和分型的分子標記。

研究對象和取材

        研究對象：各類腫瘤、發(fā)育、干細胞分化的不同階段。

        取樣標準：腫瘤組織與正常組織有明顯區(qū)別，組織病理切片分析腫瘤樣品中腫瘤細胞的比例在80%以上;正常樣品中幾乎不含有腫瘤細胞，或以血液作為正常對照。

新一代測序方案

        RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)基于MspⅠ酶切消化和bisulfite處理的高性價比方法，可對基因組promoter區(qū)及CpG島區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)進行樣品之間的比較分析。

        MBD-Seq(Methylated DNA Binding Domain Sequencing)由于在哺乳動物中甲基化一般發(fā)生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，所以可通過特異性結合甲基化DNA的蛋白MBD2b富集高甲基化的DNA片段，并結合第二代高通量測序，對富集到的DNA片段進行測序，從而檢測全基因組范圍內的甲基化位點。

        MeDIP-Seq(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing )通過使用5' -甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA片段，然后將富集后的DNA進行高通量測序。

        BS(Bisulfite Sequsencing)Bisulfite處理能夠將基因組中未甲基化的C堿基與甲基化的C堿基區(qū)分開來，因此成為表觀遺傳學研究的經(jīng)典實驗方法。將Bisulfite處理與高通量測序技術的結合的Bisulfite Sequencing能夠繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，可用于研究特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關聯(lián)。

案例解讀

案例(一)RRBS作為一種高性價比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用前景

        RRBS是一種準確、、經(jīng)濟的DNA甲基化研究方法，通過酶切富集啟動子及CpG島區(qū)域，并進行Bisulfite測序，同時實現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測的高分辨率和測序數(shù)據(jù)的高利用率。研究者進行了全基因組甲基化測序(BS)和RRBS的比較，發(fā)現(xiàn)RRBS在啟動子，CpG島區(qū)域具有更高的覆蓋倍數(shù)，并且RRBS和BS具有很好的相關性。RRBS可作為一種更經(jīng)濟的研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用前景。

圖1. RRBS和BS在CpG島平均覆蓋深度的比較，其中RRBS的測序數(shù)據(jù)為6G，BS的測序數(shù)據(jù)是103.5G



圖2. RRBS和BS甲基化水平的相關性分析

案例(二)運用ERRBS甲基化測序研究前列腺癌

        研究者通過Enhanced Reduced Representation BisulfiteSequencing(ERRBS)對7個局限性前列腺癌(PCa)組織樣本，7個對應的良性前列腺(Ben)組織樣本，6個去勢抵抗前列腺癌(CRPC)組織樣本進行了高通量測序。通過對三組樣本的分析，發(fā)現(xiàn)甲基化程度隨著疾病嚴重程度的增加而增加，進一步的研究發(fā)現(xiàn)大部分的PCa甲基化改變發(fā)生在等位基因特異甲基化區(qū)域。

B.韋恩圖顯示從Ben到PCa和從PCa到CRPC的甲基化程度增加的CpG島區(qū)域的交集

案例(三)運用MBD-seq找到神經(jīng)母細胞瘤預后甲基化生物標志

        研究者通過methyl-CpG-binding domain (MBD-seq)方法，對8個神經(jīng)母細胞瘤細胞系進行了高通量測序。通過高通量測序，初步篩查到了43個候選的生物標志。后期研究者又通過在89個初級神經(jīng)母細胞瘤腫瘤樣本中進行進一步的PCR驗證，zui后篩查出了HIST1H3C 和GNAS的甲基化水平和總生存率以及無事件存活率相關。

圖4. HIST1H3C 和GNAS的甲基化水平和總生存率以及無事件存活率的相關性分析。U代表未甲基化的病例，M代表甲基化的病例

案例(四)通過MeDIP-seq找到了急性髓細胞白血病*的甲基化區(qū)域

        研究者通過對12個急性髓細胞白血病(AML)病人和4個正常人的骨髓進行了MeDIP-seq。通過聚類分析，找到了AML的*的甲基化區(qū)域。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，SPHKAP, DPP6, ID4這三個基因在AML中表達量很低，用去甲基化的藥物處理后，這些基因的表達量都有不同程度的升高。

圖5. SPHKAP, DPP6 和ID4 在AML中的表達量。(A.1, B.1, C.1) 分別代表SPHKAP, DPP6, ID4 在AML和正常組織中的
表達水平(A.2,B.2, C.2)分別代表SPHKAP, DPP6, ID4在 OCI-AML2和CTS細胞系用DAC處理前后的表達水平。

參考文獻

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