一、引物設計中的幾個注意事項
1、 引物設計用相關的軟件來進行設計，考慮引物自身回折、錯配、引物二聚體、復性溫度、產(chǎn)物變性溫度等問題，其中產(chǎn)物的變性溫度是大家不太關心的問題，但有些產(chǎn)物在一般的95度條件下不能充分解鏈，會嚴重影響實驗結果。
2、 引物所設計的片斷一定要有足夠的特異性，選擇好片段后，到互聯(lián)網(wǎng)中進行相關的搜索，看在樣本的基因組有沒有相擬的基因以及假基因等，如果有，則可選擇特異性更高的區(qū)域。
3、 在進行mRNA表達量的定量，可以在引物設計時考慮基因組的污染問題，即在引物設計時讓兩個引物跨一個內含子，這樣基因組污染所造成的擴增可以區(qū)別出來，或因為片段過大而不能擴增
4、 由于mRNA表達量的定量有一個逆轉錄的過程，如果逆轉錄是用poly（T）作引物，則設計的片段盡量靠近poly（A），以免逆轉錄的效率影響到實驗結果。如果用特異性引物進行逆轉錄，則要考慮引物區(qū)是否存在RNA二級結構的問題
5、 產(chǎn)物片段的大?。憾縋CR一般產(chǎn)生片段都不大，不會超過600bp。SybrGreen法一般選擇250-600bp，過大會影響到PCR擴增的效率，過小則很難通過融解曲線與引物二聚體分開，但并不是的。Taqman法的擴增片段都很小，幾十或是100多，這是其原理造成的。Molecular beacon法對片段大小的要求不高，只要不是太長即可。
二、Sybr Green法的實驗策略：
實驗可分為三個階段，即實驗條件的優(yōu)化、預實驗和正式實驗。
1、 實驗條件的優(yōu)化階段，這一階段是zui花時間的，
（1）、 要找到一個陽性的模板，可以是克隆有基因質粒、強陽性樣本或純化的PCR產(chǎn)物等。有了陽性的模板才能進行zui基本的定量擴增實驗，如果有普通PCR的實驗條件，也可以此為基礎進行實驗。
（2）、 擴增出的產(chǎn)物要通過電泳方法確定其大小，以確認定量PCR擴增的產(chǎn)物是你的目的基因，有些用戶就發(fā)生過優(yōu)化了幾天的條件才發(fā)現(xiàn)擴增片段的大小不對，不是自己想要的基因。當然，能測個序什么的。并通過融解曲線實驗來確定產(chǎn)生的Tm值以及所用的變性溫度是否已經(jīng)足夠，個別情況下會出來解鍵不充分的現(xiàn)象。
（3）、 有了基本的PCR條件后，要將陽性模板進行倍比稀釋，一般用10倍稀釋。將稀釋的模板帶上陰性對照，分成多份進行溫度梯度實驗，對復性溫度進行優(yōu)化，以找出復性溫度范圍，復性溫度能滿足以下條件：高中低模板濃度下PCR擴增效率都很高、陰性模板沒有擴增。選擇滿足條件的中間溫度，這樣可以提高實驗的穩(wěn)定性，不會因為樣本管在加熱模塊中的位置不同而影響實驗結果。
（4）、 如果找不到合適的條件，如引物二聚體過多，可對引物濃度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進行優(yōu)化，然后再進行復性溫度梯度實驗。其中Mg2+離子濃度、DMSO含量都會影響Tm值以及所用的變性溫度。
