上海滬震培訓(xùn)（細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的方法）僅共參考

細(xì)胞凍存前，仔細(xì)檢查細(xì)胞凍存所需的儀器和試劑是否齊全：一般主要有：傳代細(xì)胞單層、適宜生長(zhǎng)液、滅活小牛血清、慶大霉素溶液、7.5％NaHC03溶液、0.25％胰蛋白酶溶液、標(biāo)簽用具：100ml方瓶（培養(yǎng)細(xì)胞用）、克氏瓶、紅翻帽塞、吸管（10ml、lml）、細(xì)胞凍存管、二甲基亞砜、CO2孵箱、超掙臺(tái)、倒置顯微鏡、2～8℃冰箱、-20℃冰箱、液氮罐

細(xì)胞凍存開：人羊膜細(xì)胞,WISH細(xì)胞

1．細(xì)胞：選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次。

2．計(jì)數(shù)：按常規(guī)方法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，令細(xì)胞密度達(dá)5×106/ml，離心去上清，吸入離心管中。

3．凍存液：先用培養(yǎng)液9分＋DMSO 1分（或甘油）配成10％的DMSO凍存液，按上法一滴滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。

4．分裝：分裝入無菌安剖中，每安剖加1.5毫升細(xì)胞懸液。

5．封口：用塑料安剖時(shí)擰緊瓶口即可；人羊膜細(xì)胞,WISH細(xì)胞如用火焰封閉安剖口后，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時(shí)可浸入藍(lán)色液中觀察，為安全起見，把安剖縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時(shí)因受熱發(fā)生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細(xì)胞名稱，凍存日期，以便日后查找。

復(fù)蘇方法

1．從液氮罐中取出安剖；有時(shí)因安剖未封嚴(yán)，浸入了液氮，取出后因安剖內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸，因此應(yīng)帶有防護(hù)眼睛和手套。

2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍。

3．剪開紗布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，凈化臺(tái)上打開蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮。

4．低速離心（500～1000轉(zhuǎn)/分）5分鐘，取上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。

5．加入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。

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