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合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分,用化學物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方,是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達10多余種,有的培養(yǎng)基仍在不斷進行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基,目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標準化的商品,從zui初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基,并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。
一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì):無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。
●無機鹽:CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。
●氨基酸:*、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、*、*(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料,不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外,還需要*(glutamine)。*具有特殊的作用,對細胞的培養(yǎng)特別重要,能促進各種氨基酸進入細胞膜;它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源,還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要*合成核酸和蛋白質(zhì),*缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應補加一定量的*。值得注意的是:*在溶液中很不穩(wěn)定,故4℃下放置1周可分解50%,使用中單獨配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培養(yǎng)液中。
●維生素:是維持細胞生長的一種生物活性物質(zhì),在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶,對細胞代謝有重大影響。*(A、D、E、K)常從血清中得到補充。*包括牛物素、*、*、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。*也是*的,對具有合成膠原能力的細胞更為重要。
●碳水化合物:是細胞生命的能量來源,有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動物細胞時,幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用:乳酸是葡萄糖不*氧化的產(chǎn)物。研究表明,體外培養(yǎng)條件下95%的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?,這降低了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率,降低培養(yǎng)基pH值,增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下,NADH轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+,細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應生產(chǎn)乳酸和NAD+,從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下,直接導致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下,葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解,產(chǎn)生過量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)zui常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量過低可造成細胞營養(yǎng)供應不足,細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達量等參數(shù)進行綜合考慮方可應用。
在目前常用的培養(yǎng)基中,葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細胞的主要能源,其能量代謝通路與體內(nèi)*不同,表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細胞提供能量,谷胺酰胺大部分通過不*氧化途徑,另一小部分通過*氧化為細胞供能。因此,適當?shù)恼{(diào)整細胞內(nèi)的代謝途徑,使之能促進細胞的快速生長和產(chǎn)物合成,同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。
許多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和*的消耗利用很快。然而對于細胞生長而言,二者的快速利用并非細胞必需;相反相當一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨,以及一些非必需氨基酸如*,*。其中,乳酸和氨是兩種主要代謝廢物,其積累可影響細胞生長以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累,是大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。
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