本試劑盒采用雙抗體夾心法，雙抗體夾心原理，是基于要測試的抗原具有二價以上的特性，
能識別包被抗體，同時能識別檢測抗體，具體過程如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)，并用
無關(guān)蛋白封閉空余結(jié)合位點。
（2）加受檢標(biāo)本使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體
結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
（3）加*標(biāo)記抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與*標(biāo)記抗體結(jié)合。*洗滌未
結(jié)合的*標(biāo)記抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
（4）加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素，使*標(biāo)記抗體與辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素結(jié)
合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)記物。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
（5）加入底物顯色，即可計算標(biāo)本濃度。
（6）注：一個抗體分子上可以標(biāo)記上若干個*分子，一個*分子可以結(jié)合一個辣
根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，從而帶來了大量的辣根過氧化物酶結(jié)合到抗體上，比傳統(tǒng)的直
接辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體具有更高的敏感性和放大效應(yīng)。
【魚 GnRH 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理】
本實驗采用雙抗體夾心 ELISA 法。所提供的 ELISA Kit 是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定
試劑盒（ELISA）。預(yù)先包被的抗體為抗魚 GnRH 單克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體，
經(jīng)*（biotin）標(biāo)記。樣品和*標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS 或 TBS 洗
滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過 PBS 或 TBS 的*洗滌后用底物 TMB
顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色
的深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān)。
【魚 GnRH 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理示意圖】
*步
第二部
第三步
第四步
【試劑盒組成】
名稱 96 Tests
48 Tests
保存條件
1．魚 GnRH 抗體包被板條
8×12
8×6
4/-20℃
2．魚 GnRH 標(biāo)準(zhǔn)品
2 支（凍干） 1 支（凍干）
4/-20℃
3．濃縮*化魚 GnRH 抗體
1 支
1 支
4/-20℃
4．濃縮酶結(jié)合物(ABC)
1 支
1 支
4/-20℃
5. 酶結(jié)合物(ABC)稀釋液 1 瓶 1 瓶 4/-20℃
6．抗體稀釋液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
7．標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
8．樣品稀釋液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
9．濃縮洗滌液
1 瓶（25×）
1 瓶（25×）
4/-20℃
10．顯色劑 A
1 瓶
1 瓶 (避光)
4/-20℃
11．顯色劑 B
1 瓶 1 瓶
4/-20℃
12．終止液
1 瓶 1 瓶
4/-20℃
13．說明書
1 份 1 份
室溫
【試驗所需自備試驗設(shè)備和器材】
1.
酶標(biāo)儀(450nm 檢測波長濾光片，570nm 或 630nm 校正波長濾光片) 。
2.
洗板機（可調(diào)注液量，保證每孔 350μl 洗液而不溢出）。
3.
超凈工作臺，生物安全柜，通風(fēng)柜。
4.
高精度單道加液器（量程為 0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
5.
高精度多道加液器（8 道或 12 道，量程為 50-300μl).
6.
37℃恒溫箱。
7.
低溫離心機。
8.
電冰箱（4
,
℃ -20
,
℃ -86℃）.
9.
分析天平。
10. 剪刀，鑷子，鉗子等。
11. 漩渦混合儀，低頻振蕩器等。
【試驗所需自備試驗耗材及試劑】
1.
離心管（容量為 1.5ml，5ml 等）。
2.
一次性吸頭（量程為 0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.
3.
純凈水或蒸餾水。
4.
坐標(biāo)紙。
5.
吸水紙。
6.
EDTA，*，肝素
【標(biāo)本收集注意事項】
1.
收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
2.
血清和血漿避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。
3.
標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
4.
標(biāo)本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃電冰箱內(nèi)，避免
反復(fù)凍融。
5.
可根據(jù)標(biāo)本的實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù)) 。
6.
收集標(biāo)本，盡量做到雙份的用量，避免一次實驗失敗，重復(fù)實驗時標(biāo)本缺失，從而耽誤
實驗進(jìn)程。
7.
收集標(biāo)本時，應(yīng)該做好防護(hù)措施（比如戴手套，口罩，護(hù)目鏡等），認(rèn)為所有標(biāo)本都具
有一定的潛在危險性。
8.
樣本處理應(yīng)該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。
【標(biāo)本處理辦法】
1.
血清：將采集的全血靜置冰箱 4℃過夜，然后 1000-3000rpm 離心 10 分鐘，取上清立即
測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）保存。
2.
血漿：用 EDTA，*，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm 離
心 10 分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）
保存。
3.
組織勻漿：切取組織塊，0.01MPBS 中過洗一次；按照 1G 組織加入 5-10ml 組織蛋白萃
取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm 離心 10 分鐘，取上清立
即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）保存。
4.
細(xì)胞培養(yǎng)上清：1000-3000rpm 離心 10 分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃
（1-3 個月）或-80℃（3-6 個月）保存。
5.
尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm 離心 10 分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以
放入-20℃（1-3 個月）或-80
3
℃ -6 個月）保存。
注：樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測因子的含量，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣
品中待測因子的濃度處于 ELISA 試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應(yīng)有詳細(xì)記錄。
【注意事項】
1．試劑盒使用前請保存在 2-8℃。除復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品，其他成分不可凍結(jié)。
2．濃縮*化魚 GnRH 抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會
使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或 1000rpm 離心 1 分鐘，以使附著管壁
或瓶蓋的液體沉積到管底。
3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，使結(jié)晶*溶解后再配
制洗滌液。
4．測試過程中，魚 GnRH 凍干標(biāo)準(zhǔn)品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解
兩小時候后，會迅速失活。
5．操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，本試劑不同批號組分不得混用。
6．配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y試結(jié)果尤為重
要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕晃動酶標(biāo)
板 1 分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應(yīng)液混勻。
7．實驗用酶標(biāo)儀應(yīng)嚴(yán)格按使用說明書規(guī)范操作，并在使用前充分預(yù)熱。
8．酶免試驗中魚 GnRH 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作復(fù)孔。
9．將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中，置 2-8℃保存。
10．顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
11．超過使用有效日期的試劑盒不能應(yīng)用于實驗中。
12．試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時，波長應(yīng)該設(shè)置為 450nm
和 630nm.
13．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按生物廢棄物處理。終止液為 2M 硫酸，使用
時必須注意安全。
14．各步驟加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校準(zhǔn)其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時
間控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
15．每次試驗測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本
OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔zui高濃度的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，
計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。
16．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
17．以洗板機洗板時,每孔注液量不應(yīng)少于 350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板
時, 用帶紙屑的吸水材料應(yīng)慎重, 防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生
反應(yīng)。
18．用終止液終止反應(yīng)后，請于 10 分鐘內(nèi)讀取 OD 值。
19．進(jìn)行復(fù)孔實驗時，結(jié)果計算一定要求平均值。
20．標(biāo)本溶血可能會有假陽性結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
21．試驗時，應(yīng)該將加過樣品的板條放于密閉盒內(nèi)，并保持濕度約 60%左右。
22．為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為 37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準(zhǔn)。以確保實驗溫度保持
恒定。
23．48T 的試劑盒，所有組分均為 96T 的 50%的量。
24．如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。
【檢測前準(zhǔn)備工作】
1. 請?zhí)崆?20 分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進(jìn)行試驗。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 。
3. 魚 GnRH 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.0ml 至凍干魚 GnRH 標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置 10 分鐘，待
其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為 1000 pg/ml)，之后在管身標(biāo)注①，然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。
(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/ml)。 注意：務(wù)
必要保證凍干標(biāo)準(zhǔn)品*溶解和混勻。
4. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例： 取 7 支潔凈的試劑管，分別標(biāo)注
,
,
,
,
,
,
.
② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
每管加入
300μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。從第①管內(nèi)取出 300μl 加入到第②管，混勻后，再從第②管取出 300μl
加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為陰性對照使用。
注：復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000 pg/ml）請廢棄，不可重復(fù)使用。
5.*化魚 GnRH 抗體工作液：按當(dāng)次試驗所需用量，用抗體稀釋液稀釋濃縮*化抗
體(1:100)，配置成*化抗體工作液。使用前 30 分鐘準(zhǔn)備。僅供當(dāng)日使用。
6.酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗所需要用量，用酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1:100)，
配置成酶結(jié)合物工作液。使用前 30 分鐘準(zhǔn)備。僅供當(dāng)日使用。
7.TMB 顯色工作液：在使用之前 30 分鐘，按 TMB 顯色液 A 9 份加 TMB 顯色液 B 1 份（9：
1）的比例配制 TMB 顯色工作液。
【洗滌方法】
1．自動洗板機：要求注入的洗滌液為 350μl，注入與吸出間隔 20－30 秒。確保機器運用熟
練后，再投入實驗中使用。
2．手工洗板：每孔加洗滌液 350μl，靜置 30 秒后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。手工洗
板時，注意加入洗液的過程中，不要造成孔間污染，從而出現(xiàn)跳孔的現(xiàn)象。
【操作步驟】
1.
從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)封
存于 2-8℃。
2.
預(yù)留空白孔（若使用雙波長讀板，空白孔可以不設(shè)）。
3.
分別將標(biāo)本或不同濃度魚 GnRH 標(biāo)準(zhǔn)品（0pg/ml 孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）加入相應(yīng)孔中
(100μl/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育 90 分鐘。
4.
提前 30 分鐘制備*化魚 GnRH 抗體工作液。
5.
洗板 3 次。
6.
加入*化魚 GnRH 抗體工作液(100μl/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育
60 分鐘。
7.
提前 30 分鐘制備酶結(jié)合物工作液。室溫避光放置。
8.
洗板 3 次。
9.
除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100μl/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱，避
光孵育 30 分鐘。
10. 洗板 5 次。
11. 加入 TMB 顯色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線高
濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時候，即可終止。試驗顯色反應(yīng)請勿超過 30 分
鐘。
12. 加入終止液（包括空白孔）100μl/孔，混勻后即刻測量 OD（450nm）值(10 分鐘內(nèi))。
【結(jié)果判斷】
1．每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。（若不減零孔值，標(biāo)準(zhǔn)曲線的零孔應(yīng)相
交于 Y 軸）
2．手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD 值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品
的坐標(biāo)點。通過標(biāo)本的 OD 值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行
分析，如 curve expert 1.3 進(jìn)行結(jié)果計算。
3．若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
【參考曲線】
注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算標(biāo)本含量。
【操作程序總結(jié)】
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng) 90 分鐘
洗板 2 次，加入*化抗體工作液，37℃反應(yīng) 60 分鐘
洗板 3 次，加入 ABC 工作液，37℃反應(yīng) 30 分鐘
洗板 5 次，加入 TMB 顯色液，37℃反應(yīng)
加入 TMB 終止液
10 分鐘之內(nèi)酶標(biāo)儀測 OD 值
計算標(biāo)本待測因子含量
試劑盒參數(shù)
【檢測范圍】1000pg/ml-15.6pg/ml
【靈敏度】zui小可測魚 GnRH 達(dá) 5pg/ml.
【特異性】系統(tǒng)和其它因子無交叉反應(yīng)。
【批間差】≤12%.
【批內(nèi)差】≤8%.
【回收率】70-110%.
【保存】-20
[
℃ 短期內(nèi)（如兩周）可 4
]
℃
【用途】用于體外定量分析液體標(biāo)本（通用型）。
【規(guī)格】96T.
【生產(chǎn)日期】見酶標(biāo)板鋁箔袋封口鋼印。
【有效期】12 個月（-20℃）.