齊一生物科技（上海）有限公司編輯報道：

[實驗原理] 
DNA 測序（DNA sequencing）是對DNA 分子的一級結(jié)構(gòu)的分析。其基本原理是DNA 的復(fù)制反應(yīng)體系中需要存在DNA 聚合酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成雙鏈后，DNA 聚合酶在引物的引導(dǎo)下在模板鏈上沿3’→5’的方向移動，dNTP 按照堿基配對原則，逐個連接在引物的3’-OH 末端。然而，如果在DNA 合成體系中加入雙脫氧核苷三磷酸（2’,3’-ddNTP），后者與dNTP 的區(qū)別在于脫氧核糖的C3 位置缺少-OH，這樣，一旦2’,3’-ddNTP 摻入到DNA 鏈中，由于沒有3’-OH，不能同后續(xù)的dNTP 形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的引物鏈在此終止。
DNA 自動測序技術(shù)也采用了這一基本原理。即在反應(yīng)體系中除了加入正常反應(yīng)所必需的4 種dNTP 外，還加入了一定比例的4 種熒光染料基團標(biāo)記的2’,3’-ddNTP，鏈合成過程中，dNTP 和熒光染料基團標(biāo)記的2’,3’-ddNTP 處于一種競爭狀態(tài)，結(jié)果DNA 合成反應(yīng)的產(chǎn)物是一系列長度不等的具有熒光信號的多核苷酸片段，借助計算機自動數(shù)據(jù)處理zui終得到 DNA 堿基的排列順序。
[試劑與儀器]
試劑：1. BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit:
⑴ Ready Reaction Mix; ⑵ 陽性對照模板和引物; ⑶ BigDye Terminator v3.1Sequencing Buffer (5×)。
2. 目的基因測序引物。
3. 99%乙醇；125mM 的EDTA；3M 醋酸鈉（pH 5.2）；70%乙醇。
4. Hi-Di 甲酰胺。
儀器：1. MicroAmp? 96-Well Reaction Plate；
2. PCR 擴增儀（GeneAmp PCR System 9700）；
3. 低溫高速離心機；
4. DNA 序列分析儀（ABI 公司3130 基因分析儀）。
[操作方法]
1. 模板的準(zhǔn)備（PCR 擴增產(chǎn)物）
⑴ 目的基因的擴增與純化：
一般來說，任何可以去除dNTPs 和引物的方法都是可行的。這里使用Microcon-PCR單個樣品PCR 產(chǎn)物純化柱（Millipore, #1045062）。
⑵ 確定PCR 擴增并純化后的目的基因的質(zhì)量：
應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法檢測純化后目的基因的質(zhì)和量。對測序用PCR 產(chǎn)物的量的要求見下表。
PCR 產(chǎn)物 應(yīng)用量
100–200 bp 1-3 ng
200–500 bp 3-10 ng
500-1000 bp 5-20 ng
1000-2000 bp 10-40 ng
>2000 bp 20-50 ng
2. 測序反應(yīng)
⑴ 測序反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備：按下列比例配制。
Ready Reaction Premix (2.5×) 2μl
BigDye Sequencing Buffer (5×) 1μl
引物 3.2 pmol
模板 見PCR 產(chǎn)物應(yīng)用量
去離子水 至10μl
總體積 10μl
⑵ 測序反應(yīng)的條件：
96℃1min→（96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min）×25 循環(huán)→4℃ 保溫