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酶聯(lián)法檢測梅毒螺旋體抗體

[檢測方法] ELISA法

[方法學(xué)原理] 用精制的基因工程表達(dá)的梅毒螺旋體特異性抗原包被固相載體，加患者血清后，如患者血清中有相應(yīng)抗體，可形成抗原抗體復(fù)合物。在此基礎(chǔ)上加入酶標(biāo)記抗原，即可形成抗原—抗體—酶標(biāo)記復(fù)合物。再加入酶底物，底物經(jīng)酶分解后顯色，即為陽性反應(yīng)。反之，若患者血清中無相應(yīng)抗體，則酶標(biāo)記抗原就不能與包被抗原相結(jié)合，從而加入酶底物不會顯色，此為陰性反應(yīng)。

[標(biāo)本準(zhǔn)備] 靜脈血2ml，不抗凝。

[試劑]

1．TP酶標(biāo)板

2．TP陽性對照

3．TP陰性對照

4．TP酶標(biāo)試劑

5．顯色劑A

6．顯色劑B

7．終止液

8．濃縮洗滌液

[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。

[檢測步驟]

1．配制洗滌液 將50ml濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋至1 000ml備用。

2．根據(jù)標(biāo)本數(shù)量，將酶標(biāo)板條固定于板架上，每板設(shè)陰性對照2孔，陽性對照2孔，空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步相同)。

3．加酶 每孔加100gl酶標(biāo)試劑。

4．加樣 分別在相應(yīng)孔中加入待檢樣品，陰性對照、陽性對照20u1，振蕩混勻。

5．溫育 用封板膜封板后，置37℃環(huán)境中溫育60min。

6．洗滌 小心將封板膜揭掉，用洗滌液充分洗滌6遍，zui后一次盡量拍干。

7．顯色 每孔加顯色劑A、B各50ul，輕輕混勻，用封板膜封板后置37℃環(huán)境中避光顯色15min。

8．測定 每孔加終止液50gl，混勻，以空白調(diào)零點(diǎn)，用酶標(biāo)儀450nm波長測定各孔OD值。

[結(jié)果判定]

1．臨界值(cutoff)計算cutoff＝陰性對照孔OD均值+0．18。

2．陽性判定 樣品OD值≥cut off值為梅毒螺旋體抗體陽性。

3．陰性判定 樣品OD值

[正常參考值] TPAb陰性

[注意事項)

1．檢測必須符合實(shí)驗室管理規(guī)范和生物安全守則的規(guī)定。操作時必須戴手套、穿工作服，嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離制度。所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

2．梅毒螺旋體抗體檢測結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，在正常情況下，本試驗陰性對照孔OD值應(yīng)≤0．10，陽性對照孔OD值應(yīng)≥0．80。若陰性對照>0．10，應(yīng)查明原因，必要時應(yīng)重新操作。

3．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)置室溫環(huán)境中平衡15～30min后再用，未用完的微孔條用自封袋密封保存。

4．洗滌液可用蒸餾水或去離子水配制。洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈，使用洗板機(jī)洗滌時應(yīng)設(shè)置30～60s的浸泡時間。

5．不同批次試劑不能混用，封板膜為一次性用品，不能重復(fù)使用。

[臨床意義] 以梅毒螺旋體為抗原檢測血清中特異性抗體，敏感性高，特異性強(qiáng)，是目前較好的檢測方法。陽性見于梅毒螺旋體感染，但此類抗體除IgM外，即使經(jīng)過足量抗梅毒治療，仍能在患者體內(nèi)持續(xù)存在甚至保留終身，因此不適于觀察療效、復(fù)發(fā)及再感染。但經(jīng)治療后，IgM比抗心磷脂抗體消失快。因此，TP-IgM的存在是活動性梅毒的一個重要指征。

1期梅毒(硬性下疳，感染后l至數(shù)周)陽性率FTA—A為81％～87％，TPA為50％～60％，RPR為68％～76％，早期診斷TPA敏感性較低。2期梅毒(感染后8—10周左右)，F(xiàn)TA-A、TPA和RPR陽性率均可達(dá)99％～100％。晚期及隱性梅毒FTA—A和TPA陽性率95％～100％，RPR下降至66％～68％。

除梅毒螺旋體感染外，一些非梅毒螺旋體感染如品他、雅司等熱帶性密螺旋體感染癥，口腔、齒槽及眼結(jié)膜等密螺旋體感染癥亦可呈假陽性；SLE血清存在的抗核抗體，F(xiàn)TA-A可呈假陽性反應(yīng)。

以RPR為代表的梅毒血清學(xué)非特異性反應(yīng)和以TP-Ab為代表的梅毒血清學(xué)特異性反應(yīng)在臨床應(yīng)用上各有其優(yōu)缺點(diǎn)，二者可聯(lián)合使用。其結(jié)果解釋見表。

梅毒血清學(xué)檢查的比較

梅毒血清學(xué)試驗方法較多，無論哪一種方法其敏感性和特異性都達(dá)不到100％。因此，對可疑病例應(yīng)采用2～3種方法聯(lián)合使用，以提高診斷的正確率。