蛋白純化的三種新工具-齊一生物編

蛋白親和標(biāo)簽是蛋白質(zhì)組研究中的一個關(guān)鍵性工具，迄今為止人們已經(jīng)開發(fā)出了許多久經(jīng)考驗的蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)，例如六聚組氨酸、HA、Myc和FLAG等等。盡管這些標(biāo)簽系統(tǒng)各具特色，但它們也分別存在著一些缺陷，還不能*研究者們的需要。

為此，Biotechniques雜志盤點了近期出現(xiàn)的三種新蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)，以便為研究者們提供更大的選擇空間。這三種蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)分別利用了高親和力單抗、無機(jī)礦物基質(zhì)、以及能夠剪切標(biāo)簽的金屬離子。（閱讀：2013年蛋白質(zhì)分析文章精選）

單克隆抗體標(biāo)簽!--?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /--

日本研究者Yukinari Kato在開發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療性抗體時，無意中發(fā)現(xiàn)了一個可用作親和標(biāo)簽的肽段。Podoplanin蛋白是一個在惡性癌細(xì)胞中高度表達(dá)的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠單克隆抗體NZ-1可以靶向該蛋白中一個14個殘基的肽段。Kato在ELISA實驗中注意到，NZ-1與podoplanin蛋白的親和力特別高，于是他與大阪大學(xué)的Junichi Takagi合作，希望將其開發(fā)成為一個蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)。

研究人員將與NZ-1結(jié)合的podoplanin肽段稱為PA標(biāo)簽，并將其與現(xiàn)有的其他標(biāo)簽系統(tǒng)進(jìn)行比較（FLAG、HA和Myc）。他們發(fā)現(xiàn)，NZ-1和PA標(biāo)簽之間的親和力更高，解離更慢。Takagi嘗試用這一系統(tǒng)來分離，哺乳動物細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的重組蛋白。這些重組蛋白的初始濃度較低，比較難于分離和純化。

研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的PA標(biāo)記蛋白，能夠有效結(jié)合NZ-1-瓊脂糖。此外，0.1 mg/ml的PA標(biāo)簽溶液可以將融合蛋白競爭性的洗脫下來。隨后，Takagi又通過NZ-1-瓊脂糖層析純化了15種不同分子量的分泌蛋白，這些蛋白的純度都超過了95%。

據(jù)介紹，這一系統(tǒng)的關(guān)鍵優(yōu)勢在于，可以在無損抗體柱的情況下很方便的進(jìn)行再生。研究顯示，高鹽緩沖液可以*去除結(jié)合在抗體上的PA標(biāo)簽，進(jìn)行60次結(jié)合-洗脫-再生的循環(huán)，也不會對柱子的結(jié)合能力產(chǎn)生任何影響。

目前，上述系統(tǒng)還不能兼容人類細(xì)胞。“我們正在晶體結(jié)構(gòu)的引導(dǎo)下，設(shè)計不識別人類podoplanin的改進(jìn)版NZ-1，只保留它與標(biāo)簽肽段的高親和力，”Takagi說。他現(xiàn)在正努力將這一標(biāo)簽系統(tǒng)應(yīng)用到蛋白質(zhì)組分析中去，希望能夠用其替代FLAG標(biāo)簽。

磷灰石基質(zhì)

人們常常用固化的抗體和金屬離子來純化重組蛋白，不過這些方案并不，存在著金屬離子析出、穩(wěn)定性低、和成本高等問題。為此。Jacobs大學(xué)的Marcelo Fernandez-Lahore用無機(jī)礦物氟磷灰石，開發(fā)了一個新的親和標(biāo)簽純化系統(tǒng)。

以磷酸鈣為基礎(chǔ)的磷灰石（例如羥磷灰石和氟磷灰石），幾十年來一直被用作生物分子的吸附劑，其優(yōu)勢在于這種物質(zhì)既沒有抗原性也沒有細(xì)胞毒性。然而，人們一直未能將它們用于層析法蛋白純化。這是因為此前的磷灰石基質(zhì)“顆粒形狀不規(guī)則，而且在某些條件下很容易溶解，”Fernandez-Lahore說。而近期商業(yè)化的CFT珠（macroporous ceramic fluorapatite）解決了上述問題。

Fernandez-Lahore實驗室在這種材料的基礎(chǔ)上，開始尋找與氟磷灰石高度親和的標(biāo)簽肽段。研究人員通過噬菌體展示篩選，發(fā)現(xiàn)肽段KPRSVSG與CFT的結(jié)合能力很強(qiáng)，于是他們決定將這個CFT結(jié)合肽段（CBP）開發(fā)成為蛋白純化的親和標(biāo)簽。

研究團(tuán)隊在CFT柱層析實驗中發(fā)現(xiàn)，由賴氨酸組成的肽段滯留時間更長。于是他們又添加了六個賴氨酸，對原本的CBP進(jìn)行優(yōu)化。研究顯示，用這種標(biāo)簽純化融合蛋白，純度超過了90%。

研究人員指出，與使用固化抗體或金屬離子的傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，CBP/CFT珠組成的系統(tǒng)可以彌補(bǔ)一些缺陷，是蛋白親和純化的另一條寶貴途徑。未來，研究人員將會用這一系統(tǒng)，對不同大小、不同特性、不同表達(dá)系統(tǒng)（例如哺乳動物或酵母表達(dá)系統(tǒng)）的蛋白進(jìn)行測試。Fernandez-Lahore還指出，這一標(biāo)簽可以“實現(xiàn)可逆的固化，有望應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷或細(xì)胞分析。”

二合一系統(tǒng)？

盡管許多蛋白與親和標(biāo)簽融合后也能夠正常工作，但不少實驗還是要求去除這些標(biāo)簽。人們往往將剪切位點設(shè)計在蛋白標(biāo)簽旁邊，以便用蛋白酶消化時能夠?qū)⑵淝邢聛怼?/p>

為了進(jìn)一步簡化這一過程，哥本哈根大學(xué)的Niels Erik Møllegaard提出了一個有趣的新標(biāo)簽系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，一個分子可以同時實現(xiàn)親和結(jié)合和蛋白標(biāo)簽的剪切，這個分子就是二價鈾酰離子（UO22+）。

Møllegaard及其團(tuán)隊研究DNA和RNA的鈾酰（uranyl）剪切已經(jīng)幾十年了。“這種物質(zhì)的剪切能力在于它能與磷酸基團(tuán)高度親和，” Mollegaard說。“我們嘗試用它進(jìn)行蛋白剪切也有好幾年了。”

四年前研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，鈾?？梢栽诘鞍字袑α姿峄倪M(jìn)行光切割。研究人員隨即想到，可以合成一個包含特異性磷酸化位點的標(biāo)簽，使其與固化的鈾酰離子結(jié)合，該系統(tǒng)可以在光切割后釋放出純化的無標(biāo)簽重組蛋白。

Møllegaard決定先將這一系統(tǒng)開發(fā)成為C端標(biāo)簽，因為此前的工作顯示鈾酰切割發(fā)生在磷酸化的N端，這樣就可以實現(xiàn)C端標(biāo)簽的*切除。蛋白酶剪切無法*去除這樣的標(biāo)簽，因為它的剪切發(fā)生在識別位點的C端。

研究人員選擇酪蛋白激酶CKII作為磷酸化標(biāo)簽肽段的激酶，因為這種酶的磷酸化發(fā)生在識別序列N端的上。他們設(shè)計的標(biāo)簽序列是SSDDD，其中三個天冬氨酸負(fù)責(zé)與鈾酰結(jié)合，兩個作為磷酸化位點。

研究人員將該標(biāo)簽的 C端與GFP融合，并在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)，隨后他們用CKII處理細(xì)菌的裂解物。研究顯示，磷酸化只發(fā)生在標(biāo)簽中的位點上。在與鈾酰- NTA-瓊脂糖珠混合時，磷酸化的GFP-tag與瓊脂糖珠發(fā)生了有效的特異性結(jié)合，而這樣的結(jié)合可以被磷酸鈉緩沖液洗脫。

為了研究鈾酰切割的具體情況，研究人員在細(xì)胞裂解物中對GFP-tag進(jìn)行了CKII處理，然后在溶液中加入鈾酰，并進(jìn)行了UV照射。他們觀察到，蛋白標(biāo)簽出現(xiàn)了光依賴性的切除。不過ESI-MS顯示，GFP的zui后一個賴氨酸也被切掉了，說明該系統(tǒng)還需要進(jìn)一步優(yōu)化，讓剪切位點更為。

現(xiàn)在，Møllegaard正在嘗試對結(jié)合在鈾酰- NTA-瓊脂糖珠上的融合蛋白進(jìn)行光切割，以便將其發(fā)展成為蛋白分離和標(biāo)簽切除的一步法系統(tǒng)。“還有許多步驟有待優(yōu)化，舉例來說，我們需要優(yōu)化紫外線照射，以便在純化柱上進(jìn)行更有效的光切割，”Møllegaard指出。

參考文獻(xiàn)：

1. Fujii Y., M. Kaneko, M. Neyazaki, T. Nogi, Y. Kato, and J. Takagi. 2014. PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affinity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin. Protein Expr Purif. 95:240-7. doi: 10.1016/j.pep.2014.01.009. Epub 2014 Jan 28. 

2. Islam, T., J. M/ Aguilar-Yañez, J. Simental-Martínez, C. I. Ortiz-Alcaraz, M. Rito-Palomares, and M. Fernandez-Lahore. 2014. A novel strategy for the purification of a recombinant protein using ceramic fluorapatite-binding peptides as affinity tags. J Chromatogr A. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2014.02.079. Available online 5 March 2014 

3. Zhang, Q., T.J. Jørgensen, P.E. Nielsen, and N.E. Møllegaard. 2014. A phosphorylation tag for uranyl mediated protein purification and photo assisted tag removal. PLoS One. 2014 Mar 5;9(3):e91138. doi: 10.1371/journal.pone.0091138. eCollection 2014.