引發(fā)適應過程中 spacer 的尋取和定點整合機制示意圖

科研試劑廠家-齊一生物

CRISPRs-Cas 系統(tǒng)是廣泛存在于細菌和古菌中的適應性核酸免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有豐富多樣的功能組分和核酸處理機制，為人類提供了迄今zui的基因組編輯技術（如 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)）和基因檢測技術（如 CRISPR-C2c2/Cas13a 系統(tǒng)），同時也為理解生命的進化與適應機制提供了前沿窗口。中國科學院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室向華研究組是我國較早從事 CRISPR-Cas 系統(tǒng)基礎研究的團隊，面對上缺乏 CRISPR 從純病毒獲取 spacer 的適應系統(tǒng)的困境，于 2014 年在古菌中建立了*（所有系統(tǒng)中第二個）CRISPR-Cas 系統(tǒng)對純病毒的適應體系，揭示了嗜鹽古菌 I - B 型 CRISPR 適應需要“引發(fā)”的本質(zhì)，提出了引發(fā)適應可能是 CRISPR 系統(tǒng)在自然界對病毒發(fā)生適應的主要模式這一重要論斷；并進一步發(fā)現(xiàn)除性外，引發(fā)適應還通過巧妙的 PAM 驗證實現(xiàn)了嚴格的異己區(qū)分和的防病毒逃逸機制，回答了困擾科學家多年的 CRISPR 適應過程的性及異己區(qū)分難題（Nucleic Acids Res., 2014，42：2483–2492；Nucleic Acids Res., 2014，42：7226–7235）。相關工作作為 CRISPR 適應領域的重要發(fā)現(xiàn)已被 Nature, Cell,Science, PNAS 等引用 80 余次。zui近，向華研究組通過對該 CRISPR 系統(tǒng)的人工改建，又在 CRISPR 適應過程中 spacer 的長度決定和定點整合的位點識別機制方面連續(xù)取得了新的進展（Nucleic Acids Res., 2016，44：4266–4277；Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654）。

CRISPR 適應過程中，spacer 整合反應往往發(fā)生于 CRISPR 結構的 leader 端且與其緊鄰的 repeat 將發(fā)生復制。以來，上普遍認為整合復合物先識別 repeat 的一端，再通過嚴格的分子尺機制識別另一端，從而確定新復制 repeat 的尺寸和序列。但有意思的是，多個研究團隊傾向于先識別序列保守的“repeat 近 leader”端，而另外有實驗室則認為是先識別“repeat 遠 leader”端。向華研究組巧妙設計了一個引發(fā) - 整合相分離的 CRISPR 適應系統(tǒng)，通過系統(tǒng)的掃描突變鑒定了 repeat 內(nèi)部兩個關鍵的整合識別元件。其中，元件 1（AACCC）嚴格位于“近 leader”端整合位點的下游 10 bp 處，而“遠 leader”端整合反應嚴格地發(fā)生于元件 2（GTGGG）下游約 10 bp 處。上述兩元件為 repeat 識別所必需，且其間距的增減可在一定范圍內(nèi)相應增減 repeat 的固有尺寸，這說明在 spacer 整合過程中并不存在 repeat 長度的分子尺機制，而是整合復合物先識別近 leader 的 repeat 的內(nèi)部關鍵元件，并通過 10-bp 左右的分子尺識別兩端的整合反應位點（Nucleic Acids Res., 2016，44：4266–4277）。有意思的是，這一重要發(fā)現(xiàn)發(fā)表不久，很快得到了上其他團隊在大腸桿菌中實驗數(shù)據(jù)的支持，說明了該機制在不同 CRISPR 系統(tǒng)中具有普遍性。

關于 spacer 長度決定機制，2016 年上兩家重要實驗室?guī)缀跬瑫r解析了大腸桿菌 spacer 獲取機器（Cas1-Cas2 復合物）在底物結合狀態(tài)下的晶體結構，他們發(fā)現(xiàn)該復合物的結構性限制提供了一個固定的分子尺，并界定了 spacer 的長度。但令人費解的是，在其它大多數(shù)的 CRISPR 系統(tǒng)中，spacer 長度并非固定不變，而是具有一定的尺寸多態(tài)性。向華研究組進一步設計了一個 CRISPR 單一引發(fā)的適應系統(tǒng)，利用高通量測序技術，分析了近 4 萬個新 spacer 的獲取過程，發(fā)現(xiàn)與自然界已有的數(shù)據(jù)一樣，這些 spacer 的尺寸并非固定不變，而是在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)正態(tài)分布。有意思的是，他們通過生物信息學分析檢測到在 spacer 倒數(shù)第三個堿基位點上的胞嘧啶（C）偏好性，對相應位點的突變則可改變獲取 spacer 的尺寸。該高通量數(shù)據(jù)結合分子遺傳學實驗分析，發(fā)現(xiàn) spacer 獲取機器不僅識別 protospacer 5’一側的 PAM 序列，而且識別 protospacer 3’端的部分序列，這一序列特異性識別可對獲取機器的分子尺機制進行微調(diào)，從而導致了 spacer 尺寸的多態(tài)性。該 spacer 獲取的大數(shù)據(jù)分析工作，還觀測到了適應機器在病毒模板上的滑脫（slip）和在整合過程中的翻轉(zhuǎn)（flip）現(xiàn)象，并進一步證明了引發(fā)適應過程中雙向?qū)と?spacer 的滑動（sliding）假說（Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654）。

上述進展為系統(tǒng)理解 CRISPR 引發(fā)適應過程（靶向引發(fā)，雙向?qū)と?，定點整合）的性與特異性提供了新的依據(jù)（圖 1），也為未來開發(fā)基于 CRISPR 精妙的適應過程的分子生物學技術奠定了基礎。