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貨號(hào)：QYS-236088
異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過(guò)程中，通過(guò)乙醛酸循環(huán)及其他過(guò)程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。

異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定原理：

ICL 催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在 LDH 的作用下生成乙醇和NAD，NADH 在 340nm 下有特征吸收峰，監(jiān)測(cè) 340nm 吸光度的減小速率可間接反應(yīng) ICL 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×3 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍-20℃保存；
試劑四：粉劑×3 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體 800μL×2 支，4℃保存；臨用前每支加入 560μL 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑仍 4℃保存；
試劑六：粉劑×3 瓶，4℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水，充分混勻待用。用不完的試劑-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

試劑    測(cè)定管
    
試劑一（μL）    300
試劑二（μL）    250
試劑三（μL）    300
試劑四（μL）    300
試劑五（μL）    20
樣本（μL）    50

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min

試劑六（μL）    300
 

將上述試劑按順序加入 1 mL 玻璃比色皿中，加試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在 340nm 波長(zhǎng)下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

注意：若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三、四、五和樣本按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min 以上，測(cè)定時(shí)加入 1220µL 混合液和 300µL 試劑六測(cè)定。

異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）試劑盒說(shuō)明書(shū)ICL 活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白中每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2443×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=2443×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=4.886×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.52×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：

比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。