牛副結(jié)核（M.pt）ELISA試劑盒本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于檢測(cè)牛血清，血漿及相關(guān)
液體樣本中副結(jié)核（M.pt）水平。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中牛副結(jié)核（M.pt）。用純化的
牛副結(jié)核（M.pt）抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中副結(jié)核（M.pt）相結(jié)合，經(jīng)
洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP 標(biāo)記的副結(jié)核（M.pt）抗體結(jié)合，形成抗體-
抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成
藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），
與 CUTOFF 值相比較，從而判定標(biāo)本中牛副結(jié)核（M.pt）的存在與否。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
說(shuō)明書(shū) 1份 1 份
封板膜 2片（48） 2 片（96）
密封袋 1個(gè) 1 個(gè)
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
陰性對(duì)照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
陽(yáng)性對(duì)照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶標(biāo)試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3 ml×1瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3 ml×1瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上
清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次
離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞
濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20分2
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分。離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待
檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品，因 NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
牛副結(jié)核（M.pt）ELISA試劑盒操作步驟：
1. 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照 2 孔、陽(yáng)性對(duì)照 2 孔、空白對(duì)照 1
孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照 50μl。然后在待測(cè)樣品孔先
加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測(cè)樣品 10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不
觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30分鐘。
4. 配液：將 30（48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至 600ml 后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30秒后棄去，如此
重復(fù) 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A 50μl，再加入顯色劑 B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15分鐘
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
結(jié)果判定：
試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10
臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品 OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為副結(jié)核（M.pt）陰性
陽(yáng)性判定：樣品 OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為副結(jié)核（M.pt）陽(yáng)性
注意事項(xiàng)
1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請(qǐng)避光保存。
6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為 630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為 2M 的硫酸，使用時(shí)必須
注意安全。3
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月

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