孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書

【產(chǎn)品簡介】

孔雀石綠因有非常好的抗菌作用和藥動(dòng)力學(xué)的特性，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，殘留危害人類健康，現(xiàn)已禁用。

孔雀石綠快速檢測試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于動(dòng)物組織（水產(chǎn)、雞、豬、牛）、牛奶、飼料等大批量樣品中的孔雀石綠快速檢測。

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物孔雀石綠和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭孔雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物孔雀石綠的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測時(shí)間： 75min

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書樣本檢測下限：

組織\水樣…………………………………………0.5ppb

飼         料…………………………………………1ppb

參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20361-2006組織檢測下限為0.5ppb

交叉反應(yīng)率：

顯性孔雀石綠……………………………………99%

隱性孔雀石綠(氧化后） ………………………  95%

回收率：

組織……………………………………………75±10%

水樣 ……………………………………………80±10%

飼料……………………………………………75±10%

【試劑盒組成】   

• 微量測試孔：每條8孔，一板12條
• 標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
• 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb
• 酶標(biāo)記物       12ml…………………………紅色帽
• 抗體工作液     7ml…………………………綠色帽
• 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽
• 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽
• 終 止 液          7ml…………………………黃色帽
• 20X濃縮洗滌液40ml……………………白色帽
• 2X濃縮復(fù)溶液  50 ml…………………… 藍(lán)色帽
• 30X濃縮樣品提取液 10 ml…………………黑色帽
• 氧化劑                   2 ml…………………… 藍(lán)色管

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)

溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量

配制洗滌液。

配液3、將30X濃縮樣品提取液用去離子水按照1：29稀釋（1份

濃縮洗滌液+29份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【所用儀器、試劑】   

儀        器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b

置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試            劑：乙腈、中性氧化鋁

【樣本前處理步驟】   

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

(1) 實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭（2）實(shí)驗(yàn)前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn) 行清潔，避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。   

樣本處理方法

（a）組織樣品處理方法：

• 稱取5±0.05g組織樣品于50ml離心管中，先加入3ml已稀釋好的樣品提取液震蕩2min；再加入10ml乙腈，充分震蕩5min，
• 加入2g中性氧化鋁；震蕩2min ，室溫4000r/min以上，離心10min；；
• 取6ml上清液于干凈離心管中，加入5ml二氯甲烷震蕩3min ，室溫4000r/min以上，離心10min；；
• 取下層清澈液體于玻璃管中，加入20ul氧化劑混勻，在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；
• 加入1ml復(fù)溶液，充分溶解干燥殘留物。
• 取100ul 上清液與100ul 已稀釋好的復(fù)溶液充分混合30s，
• 取50ul進(jìn)行分析。

        樣本稀釋倍數(shù)： 1倍

（b）水樣品處理方法：

1. 取50ul 上清液與450ul 已稀釋好的復(fù)溶液充分混合30s，
2. 取50ul進(jìn)行分析。

      樣本稀釋倍數(shù)：10倍

注意：此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠；隱性孔雀石綠的總量

【酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟：

• 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
• 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
• 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與孔雀石綠的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1 的吸光度值為0.310，樣本2 的吸光度值為1.051，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb 為2.243； 0.05ppb 為1.816；0.15ppb 為1.415；0.45ppb 為0.74；1 .35ppb 為0.343；4 .05ppb 為0.155。則樣本1 的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠的實(shí)際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以99%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

 0.05      0.15       0.45        1.35      4.05

                 孔雀石綠(ppb) [µg/kg]

            圖1：孔雀石綠檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV 

   0       0.05    0.15     0.45    1.35    4.05

             孔雀石綠 (ppb) [µg/kg]

         圖2：孔雀石綠檢測試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出孔雀石綠檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)孔雀石綠濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】

• 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
• 該試劑盒反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書齊一生物專業(yè)供應(yīng)