Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)
一、測(cè)定意義：
Annexin 是一類(lèi)廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信
號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Annexin V 選擇性結(jié)合磷酯酰*(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱 PS)。磷酯酰*主
要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類(lèi)型的細(xì)胞都會(huì)把
磷酯酰*外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰*暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎
癥反應(yīng)。而 Annexin V 和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰*結(jié)合后可以阻斷磷酯酰*的促凝血
和促炎癥反應(yīng)活性。因此 Annexin V 被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。用帶有綠色熒光
的熒光探針 FITC 標(biāo)記的 Annexin V，即 Annexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常
簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷酯酰*的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡測(cè)劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用 FITC 標(biāo)
記的重組人 Annexin V 來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰*的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)
試劑盒?？梢允褂昧魇郊?xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整
性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC 可以
進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰*結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。因
此將 Annexin V 與 PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
二、試劑盒組成：
試劑 試用裝 5T 20T 50T 儲(chǔ)存條件
Annexin V-FITC 25μl 100μl 250μl 4℃避光保存
結(jié)合液 2.5 ml 10 ml 25 ml 4℃保存
碘化丙啶 （PI） 25μl 100μl 250μl 4℃避光保存
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、移液器、1.5ml 離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、不
含 EDTA 的*消化液
四、保存條件：
4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。為長(zhǎng)期保存，可以把
Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存，Annexin V-FITC結(jié)合液可以直接-20℃

五、注意事項(xiàng)：
1、如果有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果。
2、染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
3、熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過(guò)程中也
盡量注意避光保存。
4、需自備PBS。
5、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
6、本試劑盒適用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×105，，不適用于檢測(cè)
組織樣本。
7、因檢測(cè)細(xì)胞的類(lèi)型、凋亡誘導(dǎo)劑種類(lèi)、使用的檢測(cè)儀器不同，因而流式檢測(cè)的熒光補(bǔ)償也不同，
因此建議每次檢測(cè)均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。
8、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng) Ex=488 nm; 發(fā)射波長(zhǎng) Em=530 nm。Annexin V-FITC 的綠色熒光
通過(guò) FITC 通道（FL1）檢測(cè)；PI 紅色熒光通過(guò) PI 通道（FL2 或 FL3）檢測(cè)，建議使用 FL3。熒
光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和
設(shè)定十字門(mén)的位置。

六、操作規(guī)程
1、對(duì)于懸浮細(xì)胞：
A、在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g (約1000～2000rpm) 離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用
PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。（注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過(guò)程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)
胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合。）
B、取1～5×105
重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入500μl 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
C、加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5μl碘化丙啶，輕輕混勻。
D、室溫(20～25℃)避光孵育10分鐘?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。
E、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯
微鏡下檢測(cè)，滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞即可檢測(cè)。

2、對(duì)于貼壁細(xì)胞：
A、把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，用*細(xì)胞消化液(不
用含有EDTA)消化細(xì)胞。（注：*消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，否則容易引起假陽(yáng)性）
B、細(xì)胞消化下來(lái)后，加入步驟2A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心
5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。。
C、取1～5×105
重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入500μl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞D、加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5μl碘化丙啶，輕輕混勻。
E、室溫(20～25℃)避光孵育10分鐘。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。
F、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯
微鏡下檢測(cè)，滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞即可檢測(cè)。
3、對(duì)于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測(cè)：
[注]：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測(cè)不到。
A、(選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)；或?qū)⒓?xì)胞于蓋玻片上生
長(zhǎng)，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對(duì)照組。
B、吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌兩次；或?qū)⑸w玻片用PBS洗滌兩次。
C、在500μl的結(jié)合液中加入5μl Annexin V-FITC， 5μl碘化丙啶，輕輕混勻。
D、將上述溶液滴加于培養(yǎng)板孔中，或滴加于蓋玻片表面，使長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。
E、室溫(20～25℃)避光孵育10分鐘
F、隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。