魚 羥 脯 氨 酸(Hyp) 酶 聯(lián) 免 疫 分 析
試 劑 盒 使 用 說 明 書
本試劑盒僅供研究使用。
檢 測 范 圍 ： 96T
0.2μg/L -9μg/L
使 用 目 的 ：
本試劑盒用于測定魚血清、血漿及相關(guān)液體樣本中羥*(Hyp)含量。
實 驗 原 理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中魚羥*(Hyp)水平。用純化的魚羥*
(Hyp)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入羥*(Hyp)，再與
HRP 標(biāo)記的羥*(Hyp)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加
底物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。
顏色的深淺和樣品中的羥*(Hyp)呈正相關(guān)。 用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度 （OD
值） ，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中魚羥*(Hyp)濃度。
試 劑 盒 組 成
1  30 倍濃縮洗滌液  20ml×1 瓶  7  終止液  6ml×1 瓶
2  酶標(biāo)試劑  6ml×1 瓶  8  標(biāo)準(zhǔn)品（16μg/L）  0.5ml×1 瓶
3  酶標(biāo)包被板  12 孔×8 條  9  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液  1.5ml×1 瓶
4  樣品稀釋液  6ml×1 瓶  10  說明書  1 份
5  顯色劑 A 液  6ml×1 瓶  11  封板膜  2 張
6  顯色劑 B 液  6ml×1/瓶  12  密封袋  1 個
標(biāo) 本 要 求
1．標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操 作 步 驟
1.  標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋： 本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支， 用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
8μg/L  5 號標(biāo)準(zhǔn)品  150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
4μg/L  4 號標(biāo)準(zhǔn)品  150μl 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2μg/L  3 號標(biāo)準(zhǔn)品  150μl 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1μg/L  2 號標(biāo)準(zhǔn)品  150μl 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.5μg/L  1 號標(biāo)準(zhǔn)品  150μl 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.  加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同） 、標(biāo)準(zhǔn)孔、
待測樣品孔。 在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl， 待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，
然后再加待測樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5 倍） 。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.  溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4.  配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復(fù) 5 次，拍干。
6.  加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。
7.  溫育：操作同 3。
8.  洗滌：操作同 5。
9.  顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
10 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色） 。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值） 。 測定應(yīng)在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
操 作 程 序 總 結(jié) ：
計 算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的
OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式， 將樣品的 OD 值代入方程式， 計算出樣品濃度， 再乘以稀釋倍數(shù)，
即為樣品的實際濃度。
注 意 事 項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，*使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值） ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5） 。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴(yán)格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
保 存 條 件 及 有 效 期
1．試劑盒保存： ；2-8℃。
2．有效期：6 個月