western是利用抗體檢測蛋白常用的方法，本手冊旨在表明Western-blot的技術(shù)原理、操作步驟及常見問題分析，可采用以下步驟進(jìn)行Western-blot實驗：

Western-blot技術(shù)原理：

Western Blot技術(shù)是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
實驗步驟：

Western，也稱Western blot、Western Blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。

1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)：

使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。

亞細(xì)胞組分分離方法：(參考)

制備組織勻漿(根據(jù)組織類型選擇不同的勻漿方法，進(jìn)行優(yōu)化)

離心 時間 亞細(xì)胞組分

1,000g X 10 min pellets nuclei(細(xì)胞核)

heavy mitochondria(線立體)

plasma membrane sheets(漿膜)

3,000g X 10 min heavy mitochondria(線立體)

plasma membrane fragments(漿膜)

6,000g X 10 min Mitochondria(線立體)

Lysosomes(溶酶體)

Peroxisomes(過氧化物酶體)

intact Golgi(完整高爾基體)

10,000g X 10 min Mitochondria(線立體)

Lysosomes(溶酶體)

Peroxisomes(過氧化物酶體)

intact Golgi membranes(完整高爾基體膜)

20,000g X 10 min Lysosomes(溶酶體)

Peroxisomes(過氧化物酶體)

Golgi membranes(高爾基體膜)

large dense vesicles(大高密度囊泡)

100,000g X 10 min all vesicles from ER(來自內(nèi)質(zhì)望網(wǎng)的囊泡)

plasma membrane(漿膜)

Golgi(高爾基體)

Endosomes(內(nèi)含體)

注：以上方法僅做為參考，需根據(jù)實驗條件進(jìn)行優(yōu)化。

收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

2. 電泳(Electrophoresis)：

(1) SDS-PAGE凝膠配制(參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制)

(2) 樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

(3) 上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。

為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時時間為90-120分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。

通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)：

(1)膜的選擇：推薦在Western實驗中選用PVDF膜。

硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較水浴加熱3-5分鐘，以充脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。

膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。

(2) 分變性蛋白

電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。S

DS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，

(3) 轉(zhuǎn)膜時間

轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜。

具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。

在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。

轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

4. 封閉(Blocking)：

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。

從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

對于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)：

參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用稀釋一抗。

吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r間。

回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照，通?？梢赃x用Tubulin抗體或Actin抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)：

吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。

二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)。

7. 蛋白檢測(Detection of proteins)

參考相關(guān)說明書，使用ECL類試劑來檢測蛋白。

壓片可以采用的壓片暗盒進(jìn)行。

洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。

8.Western Blot問題解答

無顯色信號問題的原因分析：

1.裂解產(chǎn)物中抗原含量不足

a. 抗原無表達(dá)或表達(dá)量過少

b. 蛋白降解或上樣量不足

c. 裂解產(chǎn)物制備失誤

2.制膠濃度比例不合適。

3.轉(zhuǎn)膜不*

4.一抗稀釋濃度過大

5.二抗與一抗不匹配

6.顯色系統(tǒng)靈敏度不足

非特意性雜帶出現(xiàn)的原因分析：

1.封閉或清洗不*

2.一抗?jié)舛冗^高

3.蛋白降解

4.抗體與非特異性蛋白交叉反應(yīng)

5.蛋白間聚集作用，形成二具體

6.轉(zhuǎn)移膜使用不當(dāng)

7.操作過程中轉(zhuǎn)移膜干燥