western是利用抗體檢測蛋白常用的方法，本手冊(cè)旨在表明Western-blot的技術(shù)原理、操作步驟及常見問題分析，可采用以下步驟進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)：

Western-blot技術(shù)原理：

Western Blot技術(shù)是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)步驟：

Western，也稱Western blot、Western Blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。

1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)：

使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。

亞細(xì)胞組分分離方法：(參考)

制備組織勻漿(根據(jù)組織類型選擇不同的勻漿方法，進(jìn)行優(yōu)化)

離心 時(shí)間 亞細(xì)胞組分

1,000g X 10 min pellets nuclei(細(xì)胞核)

heavy mitochondria(線立體)

plasma membrane sheets(漿膜)

3,000g X 10 min heavy mitochondria(線立體)

plasma membrane fragments(漿膜)

6,000g X 10 min Mitochondria(線立體)

Lysosomes(溶酶體)

Peroxisomes(過氧化物酶體)

intact Golgi(完整高爾基體)

10,000g X 10 min Mitochondria(線立體)

Lysosomes(溶酶體)

Peroxisomes(過氧化物酶體)

intact Golgi membranes(完整高爾基體膜)

20,000g X 10 min Lysosomes(溶酶體)

Peroxisomes(過氧化物酶體)

Golgi membranes(高爾基體膜)

large dense vesicles(大高密度囊泡)

100,000g X 10 min all vesicles from ER(來自內(nèi)質(zhì)望網(wǎng)的囊泡)

plasma membrane(漿膜)

Golgi(高爾基體)

Endosomes(內(nèi)含體)

注：以上方法僅做為參考，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

2. 電泳(Electrophoresis)：

(1) SDS-PAGE凝膠配制(參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制)

(2) 樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

(3) 上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。

為了電泳方便起見，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90-120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。

通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)：

(1)膜的選擇：推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。

硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較水浴加熱3-5分鐘，以充脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。

膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。

(2) 分變性蛋白

電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。S

DS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，

(3) 轉(zhuǎn)膜時(shí)間

轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜。

具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。

轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

4. 封閉(Blocking)：

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。

從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

對(duì)于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)：

參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用稀釋一抗。

吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。

回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通?？梢赃x用Tubulin抗體或Actin抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)：

吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。

回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。

二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)。

7. 蛋白檢測(Detection of proteins)

參考相關(guān)說明書，使用ECL類試劑來檢測蛋白。

壓片可以采用的壓片暗盒進(jìn)行。

洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。

8.Western Blot問題解答

無顯色信號(hào)問題的原因分析：

1.裂解產(chǎn)物中抗原含量不足

a. 抗原無表達(dá)或表達(dá)量過少

b. 蛋白降解或上樣量不足

c. 裂解產(chǎn)物制備失誤

2.制膠濃度比例不合適。

3.轉(zhuǎn)膜不*

4.一抗稀釋濃度過大

5.二抗與一抗不匹配

6.顯色系統(tǒng)靈敏度不足

非特意性雜帶出現(xiàn)的原因分析：

1.封閉或清洗不*

2.一抗?jié)舛冗^高

3.蛋白降解

4.抗體與非特異性蛋白交叉反應(yīng)

5.蛋白間聚集作用，形成二具體

6.轉(zhuǎn)移膜使用不當(dāng)

7.操作過程中轉(zhuǎn)移膜干燥