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上海雅吉生物科技有限公司

植物總DNA的快速少量抽提實驗

時間:2015-1-29閱讀:525
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DNA分子是分子生物學研究的基本材料,依不同的實驗?zāi)康目刹扇〔煌某樘岱椒ǐ@取數(shù)量和質(zhì)量不等的DNA。實驗?zāi)康氖橇私庵参顳NA抽提的主要方法,掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。

實驗方法原理    CTAB法:該方法簡便、快速,DNA產(chǎn)量高(純度稍次,適用于一般分子生物學操作)。 CTAB是一種非離子去污劑,植物材料在CTAB的處理下,結(jié)合65 °C水浴使細胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物,此復(fù)合物在高鹽(>0.7 mM)濃度下可溶,并穩(wěn)定存在,但在低鹽濃度(0.1-0.5 mM NaCl)下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后,CTAB-核酸復(fù)合物再用70-75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。再經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA,zui后經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分離出來。
實驗材料    水稻葉片
試劑、試劑盒    液氮CTAB氯仿異戊醇乙醇NH4ACEtOH
儀器、耗材    離心管離心機
實驗步驟    
1.  采集適量幼嫩葉片,用液N2研成粉末,0.4 g裝入1.5 ml離心管中(-20 ℃預(yù)冷)。

2.  預(yù)熱1.5×CTAB到95 ℃,加1 ml到裝有葉片粉末的離心管中,混勻(防止凍融)。

3.  立即置于65 ℃水浴30min,每5分鐘,上下顛倒1次。

4.  12000 g離心5分鐘。

5.  吸取上清液約600 μl,加入等體積(600 μl)氯仿/異戊醇(24:1),上下顛倒數(shù)次,至下層液相呈深綠色為止。

6.  12000 g離心5分鐘。

7.  取450 μl上清于一新1.5 ml離心管,加入1 ml 95%乙醇和45 μl 10 M NH4AC),混勻,室溫放置10min。

8.  12000 g離心10min,去上清,用75% EtOH浸洗沉淀,自然干燥約30 min。

9.  加入50 μl 1/10 TE或無菌水(含20 mM/RNase),置于4 ℃,待DNA溶解后,檢測DNA濃度及質(zhì)量。
收起 
注意事項    
1.  盡量取材幼嫩葉片,如太老,酚類物質(zhì)多,必須用10 mM的β-ME處理。

2.  研缽預(yù)凍,粉末至加CTAB前不要融化。

3.  24:1的氯仿/異戊醇抽提時動作應(yīng)輕柔,轉(zhuǎn)移用的槍頭是剪寬了的。

4.  所用試劑必需滅菌,手套。



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