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抗體的分離純化——鹽析法

時間:2015-6-1閱讀:354
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    鹽析法原理

    蛋白質(zhì)的溶解度在一定范圍內(nèi) 隨鹽的濃度變化而變化。在低鹽濃度下溶解度隨著鹽濃度升高而增加,當鹽濃度達到一定水平時,其溶解度又以不同程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白質(zhì)分子的極性基團有著靜電引力,當水中加入少量鹽類時,鹽類離子與水分子對蛋白質(zhì)分子上極性基團的影響,使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時,水的活度降低,蛋白質(zhì)表面的電荷被中和,水化膜破壞,致使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度不同而達到彼此分離的方法。

    鹽的選擇

    蛋白質(zhì)鹽析常用中性鹽,主要有硫酸銨、*、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用zui廣的是硫酸銨,其優(yōu)點是溫度系數(shù)小,溶解度大(25℃時飽和溶解度為4.1mol/L,即767g/L)。在不同的飽和硫酸銨溶液范圍內(nèi),不同蛋白質(zhì)依次析出;而且硫酸銨價廉易得,分段效果好,不容易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨濃溶液的pH常在4.5~5.5之間,市售的硫酸銨還常含有少量游離硫酸,pH值往往在4.5以下,須用氨水調(diào)節(jié)其pH值至7.0左右。

    鹽析時的注意問題

    1、鹽的飽和度:鹽的飽和度是影響蛋白質(zhì)鹽析的主要因素,不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個混合組分的蛋白質(zhì)時,鹽的飽和度常由低到高逐漸增加,每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進行離心分離后,再繼續(xù)增加鹽的飽和度,使第二種蛋白質(zhì)沉淀。如用硫酸鹽鹽析分離血漿蛋白,當飽和度達到20%時,纖維蛋白原首先析出;飽和度增至28%~33%時,優(yōu)球蛋白析出;飽和度達到33%~50%時,球蛋白析出;飽和度大于50%以上時,清蛋白析出,免疫球蛋白常在飽和度在33%開始析出。

    2、pH值:在等電點時,蛋白質(zhì)溶解度zui小,容易沉淀析出。因此,鹽析時除個別特殊情況外,pH值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點附近。

    3、蛋白質(zhì)濃度:在相同鹽析條件下,蛋白質(zhì)濃度越高越易沉淀,高濃度雖對沉淀有利,但濃度過高,也容易引起其他蛋白的共沉淀,因此,必須選擇適當濃度,盡可能避免共沉淀作用的干擾。

    4、溫度:由于高濃度的鹽溶液對蛋白質(zhì)有一定保護作用,鹽析操作一般可在室溫下進行,但在使用某些中性鹽進行鹽析時,溫度對鹽溶解度的影響比較明顯。

    5、脫鹽:蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后,常需要脫鹽才能獲得純品。zui常用的脫鹽方法是透析。通過透析袋內(nèi)外的離子交換,zui后使透析袋內(nèi)溶液的鹽濃度與外界相一致。





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