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關(guān)于腎臟“類器官”這些事！
點(diǎn)擊次數(shù)：332 發(fā)布時(shí)間：2018-3-12
腎臟組織模型來源于人類多能干細(xì)胞
2015年10月，一篇刊登在雜志Nature上的研究報(bào)告表示，科學(xué)家們在實(shí)驗(yàn)室中成功利用干細(xì)胞培養(yǎng)出了具有初步生長狀態(tài)的人類腎臟組織，而這一過程通向在實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)全功能性的移植器官又進(jìn)了一步。
干細(xì)胞是腎臟疾病建模的重要工具，也是實(shí)驗(yàn)性再生醫(yī)學(xué)和藥物篩選的重要工具。成熟的腎臟中有20多種不同的細(xì)胞類型，這增加了模型的復(fù)雜性，同時(shí)也提供了研究促進(jìn)分化的多譜系特異性條件的機(jī)會(huì)。
脊椎動(dòng)物的腎臟是動(dòng)態(tài)器官，對體內(nèi)平衡至關(guān)重要。它的功能包括流體/電解質(zhì)平衡、血壓調(diào)節(jié)和廢物過濾，這些都是生存所必需的。慢性疾病，如糖尿病和高血壓，可能導(dǎo)致不可逆的器官損害和終末期腎臟疾病。對于某些腎臟疾病，如透析和/或腎移植，存在可行的治療方案。然而，移植器官的短缺和*透析所固有的臨床挑戰(zhàn)為替代療法，包括干細(xì)胞療法提供了一個(gè)強(qiáng)有力的論據(jù)。
開發(fā)腎臟“類器官”
人類多能干細(xì)胞(hPSCs) 在非常明確的培養(yǎng)條件下，能在大約25天內(nèi)發(fā)展成腎臟類器官。通過對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的生長，使HSPCs開始分化過程。 HSPCs培養(yǎng)于來自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs) 的條件培養(yǎng)基，開始其分化過程。 MEFs含有非必需氨基酸的DMEM/F12，血清替代物，補(bǔ)充10 ng/ml bFGF。一旦hPSCs達(dá)到高度的細(xì)胞匯流，它們就被轉(zhuǎn)移到一個(gè)人工基底膜涂層的培養(yǎng)皿中，并在MEF條件培養(yǎng)基中生長2天(添加加10 ng/ml bFGF)，每天進(jìn)行培養(yǎng)基的更換。此時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)準(zhǔn)備好進(jìn)入中間中胚層。中胚層分化是通過四天的孵育與8µM CHIR99021,它是一個(gè)強(qiáng)有力的糖原合成酶激酶3(GSK3) 抑制劑在制定的培養(yǎng)基。中胚層分化階段通常持續(xù)四天。
經(jīng)過CHIR99021處理后,中胚層階段細(xì)胞繼續(xù)在APEL培養(yǎng)基中生長約三天,補(bǔ)充200 ng / mL FGF9和1µg /毫升肝素。此時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)為三維的(器官)組裝做好了準(zhǔn)備。每一種腎臟類器官都以5萬個(gè)細(xì)胞的種子為起點(diǎn)，用微量離心管離心分離*離解細(xì)胞。培養(yǎng)的類器官在APEL培養(yǎng)基生長5天，補(bǔ)充200 ng / mL FGF9和1µg /毫升肝素。FGF9和肝素在5天后從培養(yǎng)基中移除，而腎類器官在APEL培養(yǎng)基中繼續(xù)生長6-13天。由此產(chǎn)生的腎臟器官的直徑為3-5毫米，表達(dá)標(biāo)志物，形態(tài)與腎小球、近端小管、遠(yuǎn)端小管、收集導(dǎo)管、內(nèi)皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞一致。
另一種從hPSCs中生成三維腎臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法是Yoshimura描述的。 Yoshimura 14天方法如下：開始于iPSCs涂布，*天加入0.5 ng/ml BMP4 和10 µM Y27632，然后加入1 ng/ml 激活素和 20 ng/ml FGF2。第三天，細(xì)胞接受1 ng / ml BMP4和10µM CHIR99021。 第五天，添加10 µM Y27632補(bǔ)充BMP4和CHIR99021。
到第九天，隨著發(fā)育中的細(xì)胞成為中胚層,加入10 ng / ml激活素，3 ng / ml BMP4，3µM CHIR99021，0.1µM*和10µM Y27632。zui后一個(gè)混合物在第11天包括1µM CHIR99021,5 ng / ml FGF9和10µM Y27632。
到第14天，處理過的細(xì)胞以球體的形式存在，表達(dá)Osr1、Wt1、Hox11、Pax2和Six2，這都是腎單位祖細(xì)胞的特征。
基于腎臟類器官的研究具有很大的理論和實(shí)踐潛力，可以建立多種其他的方法來生成腎臟器官。
從hPSCs過渡到腎臟類器官的tips
除了實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)，還有一些小提示可以幫助確保從hPSCs到腎臟器官的順利過渡:
生長因子需要保持新鮮以保證效價(jià)，
hPSCs是非常敏感的，應(yīng)該用移液器輕輕的吸取少量。
在冰上處理人工基底膜。基底膜基質(zhì)在室溫條件下會(huì)凝固，管子和吸管預(yù)先冰過以確保在轉(zhuǎn)移過程中呈液體狀態(tài)時(shí)，效果。
為了減少變異，每次實(shí)驗(yàn)hPSCs應(yīng)該特別從冷凍庫存中解凍，而不是用持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行。
綜上所述，在嚴(yán)格的分化條件下，人類多能干細(xì)胞能夠組裝成三維結(jié)構(gòu)，表達(dá)標(biāo)志物，顯示腎細(xì)胞類型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)代表。這些腎臟組織的發(fā)展將有助于疾病建模，藥物篩選，以及新型干細(xì)胞替代療法對腎臟疾病的潛在發(fā)展。