泰樂(lè)菌素酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑盒僅供研究使用。
1 使用目的：
本試劑盒用于飼料、魚(yú)、蝦和肉類(lèi)組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中泰樂(lè)菌素(Tylosin)殘留的定量檢測(cè)。
2 實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔板包被有泰樂(lè)菌素(Tylosin)偶聯(lián)抗原，加入泰樂(lè)菌素(Tylosin)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離泰樂(lè)菌素(Tylosin)與微孔條上預(yù)包被的泰樂(lè)菌素(Tylosin)偶聯(lián)抗原互相競(jìng)爭(zhēng)抗泰樂(lè)菌素(Tylosin)抗體酶標(biāo)記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)?，用酶?biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，吸光值與樣品中泰樂(lè)菌素(Tylosin)含量成反比，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中泰樂(lè)菌素(Tylosin)的含量。  
3 試劑盒組成 
3.1 預(yù)包被的泰樂(lè)菌素(Tylosin)偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。
3.2 泰樂(lè)菌素(Tylosin)標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb 
3.3抗泰樂(lè)菌素(Tylosin)抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。
3.4顯色液A：1瓶（6ml）。
3.5顯色液B：1瓶（6ml）。
3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,  6ml），用于樣品稀釋用。
3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9說(shuō)明書(shū)一份。

4 需要而未提供的材料
4.1 設(shè)備
4.1.1波長(zhǎng)450nm酶標(biāo)儀。 
4.1.2粉碎機(jī)。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙。
4.1.7微量移液器。
4.2 試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水。
4.2.2 甲醇。
5 貯存
5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍
5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存
6 注意事項(xiàng)
6.1 使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。
6.2 不要使用過(guò)期試劑盒。
6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有泰樂(lè)菌素(Tylosin)，使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。
6.5 終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。
6.7 不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6.9 混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。
7 工作液準(zhǔn)備
7.1 泰樂(lè)菌素(Tylosin)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb
7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用
7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用
7.3 顯色劑：已備用，避免光線(xiàn)直照
7.4 反應(yīng)終止液：已備用
8 樣品處理程序（樣品在提取過(guò)程中，要嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，提取過(guò)程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋?zhuān)駝t會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
8.1.1 牛奶
脫脂奶：直接分析。
全脂奶：13000g離心15分鐘，取上清液檢測(cè)（避免取到乳脂）
8.1.2 肝臟： （稀釋倍數(shù)2）
--稱(chēng)取2g已絞碎的樣品到試管中。
--加入14ml的乙腈，然后均質(zhì)（用20000rpm均質(zhì)幾分鐘）。
--振蕩15分鐘，然后2500g離心15分鐘。
--取上清液1ml到另一玻璃管中在40-50℃下蒸干（利用氮?dú)獯蹈蓛x或者旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器）。
--加入250μl去離子水并漩渦混合。
--溶液待測(cè)。
8.1.3 雞蛋： （稀釋倍數(shù)2）
--取2g樣品到試管中，加入6mL乙腈。
--振蕩15分鐘，然后3000g離心15分鐘。
--取上清液1ml到另一玻璃管中蒸干（40-50℃）。
--加入500μl去離子水并漩渦混合。
--溶液待測(cè)。
8.1.4 蜂蜜： (稀釋倍數(shù)2)
---取蜂蜜2g，置于離心管中（約15mL），加入4mL水溶解。
--加入2ml 乙酸乙脂后，振蕩均勻。
--然后3000rpm，離心15分鐘。
--取上清液0.5ml置于萃取管中于水浴60℃下以氮?dú)獯蹈伞?br>--加入0.5ml去離子水混合，振蕩約10秒鐘。
--取100μl 待測(cè)。
推薦使用的其它樣品的前處理方法：
8.2.1 組織樣： （稀釋倍數(shù)1）
--取3g絞碎樣品置入50ml離心管中。
--加入6ml乙酸乙酯均質(zhì)。
--以3000g離心10分鐘。
--取2ml上清液置入10ml塞玻璃管中，于水浴50℃下以氮?dú)獯蹈伞?br>--于此玻璃管中加入2ml正己烷，振蕩混合。
--再加入1ml去離子水，振蕩混合約10秒鐘，以離心機(jī)3,000g離心10分鐘。
--利用吸管吸去包含中間乳化層部分的上層液（正己烷層）；
--取50μl待測(cè)。
8.2.2 血清血漿： （稀釋倍數(shù)1）
--移取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1分鐘。
--室溫3000g離心10分鐘。
--移取1ml上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?0 oC水浴中吹干。
--殘留物用0.5ml去離子水溶解。
--取100ul 待測(cè)。
8.2.3 飼料樣品： （稀釋倍數(shù)4）
--取1g飼料樣品(精細(xì)粉碎過(guò)的，有代表性的)，放入離心管中。
--加4ml乙酸乙酯劇烈混合1分鐘（用可旋轉(zhuǎn)振蕩搖床）
--室溫3000g離心10分鐘。
--移取1ml上層的乙酸乙酯至另一試管中，60 oC氮?dú)饬飨抡舾伞?nbsp;
--用1ml異辛烷/氯仿混合物(2:3混合)溶解干燥的殘留物。
--加入1ml去離子水強(qiáng)烈振蕩1分鐘。
--室溫3000g離心10分鐘。
--取100μl上層水相待測(cè)。
8.2.4 尿液： （快速處理方法）
--尿液不用處理，直接測(cè)定。（如果尿液渾濁，一定要過(guò)濾或離心）
泰樂(lè)菌素酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)酶免分析步驟
9.1 實(shí)驗(yàn)須知
9.1.1 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前請(qǐng)將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)?；販刂潦覝兀?5±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測(cè)的度和準(zhǔn)確度。
9.1.2 使用后請(qǐng)立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3 請(qǐng)不要改變分析程序
9.1.4 請(qǐng)使用的微量移液器
9.1.5 操作一旦開(kāi)始，請(qǐng)不要中斷任何程序
9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請(qǐng)嚴(yán)格按照要求操作
9.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
9.1.8 加樣時(shí)請(qǐng)勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
9.2 分析步驟
9.2.1 預(yù)先進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測(cè)
9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（10×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗泰樂(lè)菌素(Tylosin)抗體酶結(jié)合物
9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。 
9.3 37℃溫浴30min （溫浴過(guò)程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）
9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。
9.4 反應(yīng)
9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50μl顯色液A，再加 50μl顯色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之*混勻
9.4.2 37℃溫浴10min
9.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻
9.4.4 在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
10 結(jié)果計(jì)算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
10.1.2以泰樂(lè)菌素(Tylosin)濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線(xiàn)上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為泰樂(lè)菌素(Tylosin)濃度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì)數(shù)即為測(cè)定液中泰樂(lè)菌素(Tylosin)濃度C（ppb）
10.1.3由于樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋?zhuān)虼烁鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。 
10.2 半定量測(cè)定
10.1.1目測(cè)半定量測(cè)定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，泰樂(lè)菌素酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
10.1.2儀器半定量測(cè)定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

11 特異性
物質(zhì) 交叉反應(yīng)
泰樂(lè)菌素(Tylosin)                 

12 試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測(cè)下限為0.05ppb
B0吸光度*值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說(shuō)明書(shū)提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
13 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)模式（僅供參考）
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍為0.1ppb~8.1ppb。

14 分析限制
本試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。