M1（AFM1）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
1  使用目的：
本試劑盒用于檢測(cè)飼料和谷物中M1（AFM1）含量。
2  實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用直接競爭 ELISA方法，在微孔板包被有M1（AFM1）偶聯(lián)抗原，
加入 M1（AFM1）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離 M1（AFM1）與微孔條上預(yù)包被
的M1（AFM1）偶聯(lián)抗原互相競爭抗  M1（AFM1）抗體酶標(biāo)記物，用  TMB
底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)?，用酶?biāo)儀在  450nm  波長下進(jìn)行檢測(cè)，吸光
值與樣品中 M1（AFM1）含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中M1（AFM1）
的含量。
3  M1（AFM1）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書試劑盒組成
3.1 預(yù)包被的 AFM1偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。
3.2 AFM1標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：    0 ng/ml，0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7
ng/ml,8.1 ng/ml。
3.3抗  AFM1抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。
3.4顯色液  A：1瓶（6ml）。
3.5顯色液  B：1瓶（6ml）。
3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,      6ml），用于樣品稀釋用。
3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9說明書一份。
4  需要而未提供的材料
4.1  設(shè)備
4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。
4.1.2粉碎機(jī)。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙。
4.1.7微量移液器。
4.2  試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水。
4.2.2  甲醇。
5  貯存
5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍
5.2  未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存
6  M1（AFM1）酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒使用說明書注意事項(xiàng)
6.1  使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。
6.2不要使用過期試劑盒。
6.3試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。
6.4標(biāo)準(zhǔn)品中含有M1（AFM1），使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。
6.5終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.6不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。
6.7不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6.8稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6.9混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。
7工作液準(zhǔn)備
7.1M1（AFM1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml
7.2濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用
7.3樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用
7.3顯色劑：已備用，避免光線直照
7.4反應(yīng)終止液：已備用
8樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則
會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
8.1取10g粉碎的樣品，加  20ml 70%甲醇溶液
8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘
8.3用Whatman 濾紙過濾
8.4取25µl處理后的樣品，加入25µl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）
9酶免分析步驟
9.1實(shí)驗(yàn)須知
9.1.1實(shí)驗(yàn)開始前請(qǐng)將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)?；販刂潦?br />溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測(cè)的度和準(zhǔn)確度。
9.1.2使用后請(qǐng)立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3請(qǐng)不要改變分析程序
9.1.4請(qǐng)使用的微量移液器
9.1.5操作一旦開始，請(qǐng)不要中斷任何程序
9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請(qǐng)嚴(yán)格按照要求操作
9.1.7為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
9.1.8加樣時(shí)請(qǐng)勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
9.2分析步驟
9.2.1預(yù)先進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測(cè)
9.2.2取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
9.2.4在B0孔中加入50µl   0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.5在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50µl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.6在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
9.2.7在所有孔中加入50µl的抗M1（AFM1）抗體酶結(jié)合物
9.2.8輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。
9.3 37℃溫浴30min（溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）
9.3.1甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。
9.4反應(yīng)
9.4.1洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A，再加    50µl顯
色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之*混勻
9.4.2 37℃溫浴10min
9.4.3每孔中加入50µl終止液，混勻
9.4.4在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
10結(jié)果計(jì)算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）
的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
10.1.2以M1（AFM1）濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為 M1（AFM1）濃
度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì)數(shù)即為測(cè)定液中M1（AFM1）濃度C（ng/ml）
10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋
倍數(shù)。
10.2半定量測(cè)定
10.1.1目測(cè)半定量測(cè)定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光
度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
10.1.2儀器半定量測(cè)定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色
深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
11特異性
物質(zhì)交叉反應(yīng)
12試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測(cè)下限為0.1ppb
B0吸光度值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
13標(biāo)準(zhǔn)曲線模式（僅供參考）
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為
0.1ng/ml~8.1ng/ml3。