氧化磷酸化系列_線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ
測定方法：微量法
產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣
注 意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。
氧化磷酸化系列_線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ
測定原理：
復合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定復合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：80mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：2 mL×1瓶，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑五：8mL×1瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑九：液體10mL×1 瓶，室溫保存。
定磷試劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。
注意：配試劑好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
①準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿600g，4℃離心5min。
③棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選做）。
⑤步驟④中的沉淀即為線粒體，加入800uL試劑二和8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于復合體Ⅴ酶活性測定。
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