糖異生系列_丙酮酸羧化酶(PC)測試盒_微量法
測定方法：微量法
產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣
注 意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖異生過程的個限速酶，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。
糖異生系列_丙酮酸羧化酶(PC)測試盒_微量法
測定原理：
PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性。
需自備的儀器和用品：
分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體18 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：液體13uL×1支，4℃保存；
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、稱取約0.1g組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PC（此步可選做）。
5、在步驟④的沉淀中加入1mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體PC活性測定。
測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四的配制：在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和 2min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。
注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.5，需將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后測定，使ΔA小于0.5可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
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