基于原核 CRISPR-Cas 免疫系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)是近幾十年來zui強(qiáng)大的生物學(xué)技術(shù)突破之一，這種工具能對許多種類的生物進(jìn)行的遺傳改變，為基礎(chǔ)研究，生物技術(shù)和臨床醫(yī)學(xué)帶來了巨大的希望。

一期（6月2日）Cell雜志介紹了這種技術(shù)工具的升級改造，指出通過改進(jìn)Cas9酶和重編程新酶，研究人員能獲得更加適合不同基因組編輯應(yīng)用的新工具，這也加速了其在臨床上的應(yīng)用。

應(yīng)該說CRISPR-Cas系統(tǒng)是繼Meganuclease、鋅指酶和TALEN之后，又一通過各自的DNA結(jié)合域來靶向目的序列，不過這一技術(shù)使用RNA為核酸酶導(dǎo)航，不僅很容易設(shè)計，而且能夠改寫幾乎任何基因組序列。但是這并不是說CRISPR-Cas就沒有自己的局限性了，不過幸運的是，不少研究人員取得了顯著進(jìn)展，優(yōu)化了 Cas9，提高了這一技術(shù)的靈活性、保真性和精度。

zui開始，CRISPR-Cas基因組編輯技術(shù)很大程度上依賴于化膿性鏈球菌Cas9 (SpCas9)，但這種Cas9相對來說比較大，會阻礙病毒傳遞和細(xì)胞表達(dá)。2015年兩個研究組發(fā)現(xiàn)了兩個更小一些的Cas9同源物，即來自*和嗜熱鏈球菌中的Cas9，這令真核系統(tǒng)進(jìn)一步編輯更為。

SpCas9識別的是任何核苷酸后面的兩個*DNA堿基PAM序列。這將SpCas9靶向的PAM序列局限為必須包含兩個連續(xù)*的DNA序列。為了解決這一問題，麻省總醫(yī)院研究小組建立了一個工程系統(tǒng)，使得他們能夠快速地演化SpCas9識別不同PAM序列的能力。通過收集隨機(jī)突變的SpCas9變體，他們鑒別出了使得SpCas9能夠新PAM序列的突變組合。這些演化變體基本上讓SpCas9可以進(jìn)行靶向基因編輯的位點范圍擴(kuò)大了一倍。

CRISPR-Cas系統(tǒng)另一個重要的改進(jìn)就是減少脫靶效應(yīng)，這對于臨床應(yīng)用尤為重要。目前已經(jīng)報道了多種增加Cas9 特異性的方法，其中zui顯著的是由張鋒和Keith Joung*完成的一項成果：隨后任意組合改變1條、2條、3條或4條氨基酸側(cè)鏈，測試了總共15種可能的變異體，發(fā)現(xiàn)了一種三個位點發(fā)生替代的變異體：SpCas9-HF1（SP代表化膿鏈球菌，是這一廣泛使用的Cas9的來源，HF代表高保真），相比于未改變的原始SpCas9，在研究人員測試的37種不同的導(dǎo)向RNAs中，這一變異體采用85%的導(dǎo)向RNAs誘導(dǎo)出了靶向效應(yīng)。

除了SpCas9-HF1，這組研究人員還發(fā)現(xiàn)三個氨基酸突變可大大減少“脫靶”切割。利用測試的導(dǎo)向RNAs，他們證實“脫靶”切割已降低至檢測不到的水平。研究小組將這種新設(shè)計的酶命名為“增強(qiáng)型”化膿性鏈球菌Cas9（ eSpCas9 ），可用于需要高水平特異性的基因組編輯應(yīng)用。

然而，對于基因組編輯來說zui大的挑戰(zhàn)也許應(yīng)該是DNA序列替換的相對低效率。