中文名稱：豚鼠腫瘤壞死因子αelisa試劑盒

英文名稱：Guinea pig Tumor necrosis factor α,TNF-α elisa Kit 

操作程序：

① 加抗體包被 → 4℃**，洗滌三次、拋干

② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加底物液　→ 37℃ 15分鐘，加終止液

⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值

豚鼠腫瘤壞死因子αelisa試劑盒顯色的重要性

顯色是ELISA中的zui后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)判斷。

OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。

TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和SDS等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時(shí)間(12-24小時(shí))不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(450nm)測(cè)讀吸光值。

實(shí)驗(yàn)過程中酶標(biāo)比色儀的使用

    酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說，若某孔測(cè)得的A值為1.083，則該孔相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.083±0.01(1.073～1.093)，重復(fù)測(cè)定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05(1.078～1.088)在之間。酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.000～2.000，新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)2.900，甚至更高。超出可測(cè)上限的A值常以"*"或"over"或其它符號(hào)表示。應(yīng)注意可測(cè)范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測(cè)范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍為0.000～2.900，而其線性范圍僅0.000～2.000，這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。

    酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15～30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。

測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，*次在zui適波長(W1)，第二次在不敏感波長(W2)，兩次測(cè)定間不移動(dòng)ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，zui終測(cè)得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。