免疫熒光標(biāo)本的特殊處理技術(shù)
死細(xì)胞及碎片的去除 由于標(biāo)本送檢時(shí)間、實(shí)驗(yàn)操作等都會(huì)造成部分細(xì)胞死亡。為保證結(jié)果準(zhǔn)確，尤其是細(xì)胞或亞群的測(cè)定，應(yīng)當(dāng)排除死亡細(xì)胞，不然這些細(xì)胞含特異結(jié)合抗體，干擾免疫熒光分布；不完整的死細(xì)胞碎片也可貼附到活細(xì)胞上，影響DNA或免疫熒光的分布。排除方法根據(jù)細(xì)胞樣品而定，血細(xì)胞大小基本均勻一致，可根據(jù)死細(xì)胞低強(qiáng)度的前向角散射而同活細(xì)胞分開(kāi)。但培養(yǎng)細(xì)胞大小分布不均，大量的死亡細(xì)胞因體積縮小，其前向角散射可能同小細(xì)胞重疊起來(lái)難以鑒別，可采用樣品內(nèi)加入少量PI，使死亡細(xì)胞的DNA染色而加以排除。
過(guò)多的碎片也會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。為去掉碎片，可在盛1ml血清的試管內(nèi)，重層細(xì)胞懸液1—2ml在血清上，15分鐘直立后，大的碎片自行現(xiàn)于管底，再把懸液移至另一含血清試管內(nèi)，離心。此時(shí)細(xì)胞留于血清內(nèi)，小碎片在血清上層。去掉上層，并向含細(xì)胞的血清內(nèi)加入培養(yǎng)基，洗標(biāo)本數(shù)次，待測(cè)。一般情況下，可直接用儀器的處理排除碎片，避免繁瑣的操作。
染色中膜能量轉(zhuǎn)移的預(yù)防 由于細(xì)胞膜機(jī)構(gòu)的特殊性，在染色處理時(shí)會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)換，蛋白質(zhì)、糖蛋白及類脂雙層等膜成分的動(dòng)力學(xué)改變，從而形成三種現(xiàn)象：*是足夠濃度的多價(jià)抗體或單價(jià)的Fab片段，用于染色時(shí)可見(jiàn)到隨機(jī)分布的膜反應(yīng)—均勻的環(huán)形，這種現(xiàn)象也同細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)；第二種現(xiàn)象是點(diǎn)狀（Spot）分布或：“補(bǔ)丁”（Patches）狀的熒光分布，多發(fā)生在低濃度二價(jià)或多價(jià)抗體染色時(shí)。它實(shí)際是表面抗原的重新分配過(guò)程—被動(dòng)凝聚現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在體內(nèi)也會(huì)發(fā)生，冷環(huán)境，NaN3，不會(huì)制止它的出現(xiàn)；第三種是帽形成，是細(xì)胞膜物質(zhì)半月形分配，點(diǎn)狀或“補(bǔ)丁”狀可能是帽現(xiàn)象的前提。帽形成多發(fā)生在細(xì)胞高爾基體附近的特殊極點(diǎn)，是一種細(xì)胞生理現(xiàn)象。冷環(huán)境、NaN3等封閉代謝作用的物質(zhì)或條件可使其抑制。因此，為了保證細(xì)胞免疫熒光測(cè)定的和穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)盡量在冷環(huán)境中進(jìn)行，使用的緩沖液系統(tǒng)補(bǔ)加疊氮鈉。
標(biāo)本的保存和固定 試驗(yàn)中，尤其是臨床標(biāo)本，有時(shí)要保存一定時(shí)間。未染色的新鮮標(biāo)本可用以下方法貯存：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×106—1×107細(xì)胞，—70℃過(guò)夜，然后置液氮內(nèi)，可較長(zhǎng)期保存。亦可把細(xì)胞放于50%A、B型混合血清的RPMI 1640培基內(nèi)，4℃10分鐘，再緩慢加入等量20%二甲基亞砜 A、B/RPMI 1640液，放液氮?dú)庀?，再轉(zhuǎn)入液相。此種冷凍方法，在1個(gè)月內(nèi)染色的細(xì)胞群體比例不發(fā)生大的改變。也有人用20%小牛血清RPMI 1640，,10%二甲基亞礬保存細(xì)胞，—10℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)，保存時(shí)間5天。
免疫熒光染色的標(biāo)本如不能立即測(cè)定、或標(biāo)本具有傳染性，應(yīng)做標(biāo)本固定。未固定的標(biāo)本，一般在4℃可放48小時(shí)，過(guò)時(shí)將會(huì)發(fā)生細(xì)胞劈裂或熒光色素內(nèi)化，群體比列發(fā)生明顯變化。對(duì)固定的方法要求應(yīng)當(dāng)是：1、固定程序簡(jiǎn)單，試劑單一；2、固定不明顯影響細(xì)胞體積、光掃描結(jié)果及熒光特性；3、固定后必須能保存一定時(shí)間，任何染色前固定都不適用于免疫熒光染色。
常用試劑 甲醛是zui常用的理想藥品，它不但有固定膜蛋白的能力，而且可以殺滅樣品中的微生物，尤其當(dāng)代HIV-I病毒的感染。一般以1—4%多聚甲醛—PBS，pH7.2固定液，或用0.37—1.5%甲醛—PBS pH溶液。在免疫膠體金標(biāo)本固定時(shí)，常用PLP液，其組成為1%多聚甲醛pH7.3水液加9mg對(duì)位過(guò)碘酸加3ml 0.1M L-賴氨酸0.1M PBS。100%甲醇固定液熒光效果理想，但細(xì)胞易凝聚成團(tuán)。50、70、100%乙醇或乙醇：甲醇混合液效果均不理想。
固定方法 經(jīng)免疫熒光染色后，離心沉淀細(xì)胞，加入固定液混勻，放4℃保存。分析時(shí)可直接應(yīng)用或洗一次測(cè)定。如同時(shí)做DNA染色，可固定4小時(shí)，加入DNA染料，或在固定后加入70%乙醇，使細(xì)胞膜滲透性增加。實(shí)踐證明，固定保存1周至2個(gè)月，多數(shù)標(biāo)本陽(yáng)性細(xì)胞群體比例及熒光強(qiáng)度均在正常范圍內(nèi)，特別是前向角散射掃描顯示細(xì)胞大小分布規(guī)律更佳。但要注意細(xì)胞膜經(jīng)固定后通透性增加，在做免疫熒光雙染色時(shí)管道內(nèi)紅色熒光顏料的污染，造成紅熒光群體增加的假象。
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