6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 管/48 樣
測(cè)定意義：
G6PDH（EC 1.1.1.49）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，催化 6-磷酸葡萄糖氧化為 6 -磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)將 NADP+還原為 NADPH，供生物合成及維持細(xì)胞內(nèi)的還原狀態(tài)用。因此 6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的高低可以從一定程度上反映出生物體的生物合成和抗氧化能力。
測(cè)定原理：
G6PDH 催化 NADP+還原生成 NADPH，在 340 nm 下測(cè)定 NADPH 增加速率。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)每支加 550μL 蒸餾水充分溶解備用；試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)每只加 550μL 蒸餾水充分溶解備用。
樣本的前處理：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑一置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱 10min 左右。3、操作表：
試劑名稱（μL） | 測(cè)定管 |
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試劑一 | 750 |
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試劑二 | 10 |
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試劑三 | 10 |
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樣本 | 30 |
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將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，加樣本的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)；混勻，在 34 0 nm 波長(zhǎng)下記錄 1min 時(shí)的初始吸光度 A1 和 6min 時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意事項(xiàng)：若ΔA 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)?；?qū)⒎磻?yīng)時(shí)間縮短至 2min，使 A2-A1 小于 0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。
G6PDH 活力單位的計(jì)算：
1、血清（漿）G6PDH 活力的計(jì)算:
單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
G6PDH（U/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=857×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 G6PDH 活力的計(jì)算:（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
G6PDH（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=857×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
G6PDH（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=857×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
G6PDH（U/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.715×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，8×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。
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