引言：小干擾RNAs（small interfering RNAs，siRNAs）是RNA干擾（RNA interference，RNAi）過程中的效應(yīng)分子.Fire et al[1]在1998年向秀麗隱桿線蟲中注射雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子后降解了細胞質(zhì)中含有同源序列的靶mRNA.隨后的研究表明，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于真菌、擬南芥、斑馬魚、果蠅、小鼠及大鼠等大多數(shù)真核生物中.早期在哺乳動物細胞中應(yīng)用長dsRNA可引起非特異性干擾素反應(yīng)而導(dǎo)致細胞死亡，后來遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究證明將dsRNA切割成21-28個核苷酸的siRNAs后不引起干擾素反應(yīng)，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.因此，siRNAs正迅速發(fā)展成為研究基因功能的新工具和作為治療的新手段.
1、siRNAs的沉默機制
siRNAs是由RNase-III家族中被稱為Dicer的核酸內(nèi)切酶在細胞質(zhì)中剪切自然存在的長dsRNA的過程中產(chǎn)生的.Dicer將長dsRNA剪切為21-28個核苷酸的siRNA雙鏈.這種siRNA雙鏈除了在5’末端是磷酸，3’末端是羥基外，3’端還有由2個核苷酸構(gòu)成的懸突.siRNA雙鏈與誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合后裂解為siRNA單鏈，與siRNA單鏈*互補結(jié)合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，從而達到基因沉默的目的.現(xiàn)在siRNA能夠像核酶一樣通過化學(xué)合成的方法或者通過載體表達雙鏈短發(fā)夾樣RNA（short hairpin-like RNA，shRNA）進入到細胞內(nèi)，后者在細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)化為siRNA而發(fā)揮基因沉默效應(yīng).一些研究證明siRNAs還有其他沉默機制，例如在幾種生物中能夠通過RNAi途徑修飾細胞染色質(zhì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默[2-3].
miRNAs（microRNAs）是一類非編碼小分子RNA，具有和siRNAs相似的功能，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)基因表達.成熟的miRNA是由胞質(zhì)中70個核苷酸組成的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)前體剪切為21-22個核苷酸分子組成的單鏈.他們組裝成蛋白復(fù)合體（miRNP）后在核糖體內(nèi)與mRNA3’端非翻譯區(qū)部分互補結(jié)合從而阻止mRNA的翻譯.如果與同源性靶mRNA*互補結(jié)合，那么miRNAs像siRNAs一樣能夠通過正反饋途徑循環(huán)降解靶mRNA.
2、siRNAs的基因沉默效率及其安全性
各種基因沉默的方法是否能夠作用于靶目標仍然是其應(yīng)用于治療的一個關(guān)鍵問題.Harborth et al[4]研究表明RNA結(jié)合蛋白，mRNA的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)能夠影響siRNA的沉默效率.絕大多數(shù)研究都證實siRNAs比各種寡脫氧核苷酸（oligodeoxyribonucleic acids，ODNs）更有效，并且作用時間更長.作用于同樣的靶目標siRNAs的半數(shù)zui大抑制濃度（IC50）比磷硫酰修飾的ODNs低100-1 000倍.盡管尚未對siRNAs與核酶和/或DNA酶的效率進行廣泛地系統(tǒng)性比較，但Drew et al[5]研究表明siRNAs比核酶和/或DNA酶更有效，且具有長發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA比錘頭結(jié)構(gòu)的核酶能更強烈的抑制靶基因表達.
低濃度的siRNAs就能啟動基因沉默的過程，因為他們能快速、特異性與RISC結(jié)合，從而減少了與非特異性蛋白結(jié)合的可能，這有利于減少siRNAs在治療中的非特異性反應(yīng).事實上已有研究證明轉(zhuǎn)染中等濃度的siRNAs并不引起全身非特異性反應(yīng)[6].也有三項研究[7-9]認為siRNAs引起的非特異性反應(yīng)與siRNAs的濃度、細胞類型、轉(zhuǎn)染試劑以及siRNAs的轉(zhuǎn)染方式有關(guān).這些非特異性反應(yīng)包括刺激基因亞型引起的干擾素反應(yīng)，但研究并非像人們想象的那樣，所產(chǎn)生的干擾素反應(yīng)并不影響細胞生長.
3、siRNAs的表達載體
由于siRNAs既可以通過化學(xué)合成獲得，也可以通過載體表達，這使具有靶向性的藥物應(yīng)用于基因治療成為可能.表達siRNAs的載體通常含有RNA聚合酶III啟動子（RNA polymerase III promoter，pol III）或RNA聚合酶II啟動子（pol II）序列，首先轉(zhuǎn)錄生成與miRNA前體相似的shRNA，然后在細胞內(nèi)變成siRNA發(fā)揮基因沉默效應(yīng).在活體內(nèi)和培養(yǎng)組織細胞中應(yīng)用表達siRNA的載體能夠長時間整合到基因組中并“敲除"內(nèi)源性基因.許多研究證明腺病毒載體、腺相關(guān)病毒（adeno-associated viral，AAV）載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及慢病毒載體都能有效轉(zhuǎn)染到活體內(nèi)和培養(yǎng)細胞中.Shinagawa et al[10]研究表明含pol II的表達載體能在體內(nèi)產(chǎn)生由數(shù)百個堿基對構(gòu)成的shRNA，而不誘導(dǎo)非特異性干擾素反應(yīng)，這為siRNAs應(yīng)用于哺乳動物提供了一種安全的新方法.
4、siRNAs在活體中的應(yīng)用
通過電穿孔、局部注射或靜脈注射的方法已經(jīng)能夠成功地將化學(xué)合成的siRNAs、表達siRNAs的質(zhì)粒以及表達siRNAs的病毒導(dǎo)入到哺乳動物細胞中.但很難評價哪種方法能更有效的引起基因沉默.經(jīng)鼠尾靜脈高壓注射溶于生理鹽水的siRNA已經(jīng)成功地將siRNA導(dǎo)入大鼠組織中，其中在肝中靶基因的沉默效率達90%以上，而在肺、腎、脾、胰中靶基因的沉默效率稍低[11-12].采用這種方法引起的基因沉默效應(yīng)一般持續(xù)數(shù)天，在有些情況下可超過1 wk，并且基因沉默的效率因物種的差異而不同.
表達siRNAs的病毒載體為研究哺乳動物的基因功能提供了新方法，更為治療人類主要疾病帶來了新希望.已經(jīng)有幾種病毒被設(shè)計用于表達siRNAs.重組AAV能在哺乳動物分裂期細胞和靜止期細胞中長期表達siRNA.他們通常以附加體的形式隨機、低頻整合到宿主基因組中.有研究[13]表明向大鼠腦內(nèi)注射表達siRNA的AAV載體能引起長達7 wk之久的基因沉默效應(yīng).在HIV感染的組織模型中表達siRNA病毒載體也被成功地應(yīng)用于治療[14].
現(xiàn)在又有幾種新的方法將siRNAs導(dǎo)入活體內(nèi).zui近有研究[15]表明大分子能夠促進幾種小分子物質(zhì)經(jīng)皮吸收，包括siRNAs分子.這將有利于siRNAs經(jīng)皮吸收進入全身血液循環(huán)發(fā)揮治療性藥物的作用.將含siRNAs的氣溶膠導(dǎo)入肺內(nèi)也能起到基因治療的作用[16].
5、以siRNAs為基礎(chǔ)的基因治療
雖然siRNA在哺乳動物細胞中的應(yīng)用僅僅4 a，但他正以飛快地速度發(fā)展成為基因治療的一種新方法.如果siRNAs通過尾靜脈高壓注射能有效到達肝臟，那么他將可以廣泛應(yīng)用于治療各種肝病.通過沉默肝中內(nèi)源性凋亡基因的表達，經(jīng)抗凋亡酶Caspase-8或者抗Fas細胞死亡受體的siRNAs預(yù)處理的小鼠能有效預(yù)防各種試劑誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭;用同樣的siRNA也能夠治療已經(jīng)發(fā)生的肝損傷[11-12].siRNAs通過抑制病毒自身或者抑制病毒轉(zhuǎn)錄所必須的輔助因子達到抗病毒的目的.將乙型肝炎病毒（HBV）基因組和siRNAs共轉(zhuǎn)染可以有效降低HBV的復(fù)制水平和蛋白合成[17].Wohlbold et al[18]證明用siRNAs能有效沉默異常BCR-ABL融合基因表達，而不影響正常c-BCR和c-ABL的轉(zhuǎn)錄，這為治療Ph染色體陽性的慢性粒細胞白血病提供了新方法.
在血漿中siRNAs雙鏈能抵抗核酸內(nèi)切酶的降解作用，但這并不意味著他能夠穩(wěn)定地存在于機體內(nèi).因為未被修飾的siRNAs不能迅速進入細胞內(nèi)，或者與血漿蛋白親和力低而較早地被機體清除.如果不是通過表達siRNAs載體的方法，那么必須經(jīng)過化學(xué)修飾的siRNAs才能更有效的作為基因治療的手段.有研究[19-20]正通過硫磷酰修飾siRNA提高細胞的攝取能力，從而增強基因沉默的效果.去年美國FDA已批準經(jīng)過修飾的siRNAs進行臨床新藥試驗，用于治療與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變（age-related macular degeneration）的患者[21].zui近Soutschek et al[22]經(jīng)鼠尾靜脈注射*修飾的抗apoB siRNA能有效沉默同源性靶基因的過度表達，并且證實經(jīng)修飾的抗apoB siRNA導(dǎo)致小鼠*水平降低的程度與apoB基因敲除小鼠的水平相近，這實現(xiàn)了siRNA作為靜脈注射性治療藥物的可能.
siRNAs作為一種新的基因治療方法引起了許多研究者的興趣，在很大程度上是因為其作為細胞內(nèi)源性基因表達調(diào)節(jié)物質(zhì)的低毒性和特異性，另外一方面則是其比ODNs、核酶有更強的基因沉默效率.然而將siRNAs應(yīng)用于臨床治療還存在一些挑戰(zhàn)，如將siRNAs導(dǎo)入細胞內(nèi)的*方法及如何獲得更率，如何避免脫靶現(xiàn)象及非特異性反應(yīng).因此，進一步深入研究RNAi的機制將會豐富我們對基因表達調(diào)控的認識，也將有利于基因治療的實際應(yīng)用.
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