發(fā)光法測(cè)定酶的催化活性，發(fā)光法應(yīng)用熒光、磷光以及化學(xué)發(fā)光等作為檢測(cè)器體系。活的生物體中觀察的化學(xué)放 光稱(chēng)作生物體發(fā)光。生物體發(fā)光是由成為熒光素酶的酶類(lèi)催化產(chǎn)生的，這類(lèi)酶的底物即蟲(chóng)熒 光素，被轉(zhuǎn)化為發(fā)光產(chǎn)物。
在發(fā)光法中，單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)體系發(fā)射的光子數(shù)目可以由特殊設(shè) 計(jì)的儀器——照度計(jì)來(lái)測(cè)量，這類(lèi)儀器是以單光子探測(cè)器為基礎(chǔ)的，通常是光電倍增管。 由來(lái)源于螢火蟲(chóng)的熒光素酶催化的反應(yīng)就是一個(gè)例子，螢火蟲(chóng)熒光素4-單加氧酶（ATP 水解酶） ATP+D-蟲(chóng)熒光素+O2→氧合蟲(chóng)熒光素+AMP+pp+CO2+0.9hν 在該反應(yīng)中，ATP 作為底物被消耗掉，光子在 562nm 的波長(zhǎng)處發(fā)射。每摩爾的蟲(chóng)熒光 素的量子產(chǎn)量是0.9 愛(ài)因斯坦，也即消耗掉一分子ATP，大約發(fā)射1 個(gè)光子。因此該反應(yīng)適 合用來(lái)測(cè)定ATP，從而測(cè)定那些能夠催化ATP 消耗或者是ATP 生產(chǎn)的反應(yīng)的那些酶。 為借助于螢火蟲(chóng)的生物發(fā)光來(lái)檢測(cè)酶的活性，光強(qiáng)度必須在幾分鐘內(nèi)呈線性增加，而且 必須嚴(yán)格正比于酶的催化活性。這些測(cè)定條件在測(cè)定肌酸激酶的催化活性時(shí)，已經(jīng)得到了實(shí) 現(xiàn)。 磷酸肌酸+ADP→肌氨酸+ATP 其他依賴(lài)于NAD（P）的反應(yīng)可以通過(guò)來(lái)源于發(fā)光細(xì)菌的生物發(fā)光來(lái)跟蹤檢測(cè)。
過(guò)氧化物酶(ＰＯＤ)活性的測(cè)定 —愈創(chuàng)木酚法
一、實(shí)驗(yàn)原理 過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)的反 應(yīng)，產(chǎn)物為醌類(lèi)化合物。 實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為過(guò)氧化物酶的底物。 在此酶存在下，H2O2 將愈創(chuàng)木酚氧化生成 茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm 有zui大光吸 收，故可通過(guò)470nm處的吸光度變化測(cè)定過(guò) 氧化物酶的活性。
二、材料和設(shè)備
１、材料 ：馬鈴薯塊莖 ２、儀器設(shè)備：751 型分光光度計(jì)、離心機(jī)、研 缽、25ml 容量瓶、量筒、試管、吸量管。 ３、試劑：0.05ml/L愈創(chuàng)木酚溶液， 0.05ml/L的磷酸緩沖液(pH5.5)， 2%H2O2， 0.1mol/L兒茶酚溶液， 20%三氯乙酸溶液
三、實(shí)驗(yàn)步驟
１、酶液的制備 取5.0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放 入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻 漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3000g 水中離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸緩沖液再提?。泊?，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下 保存?zhèn)溆谩?２、過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定 酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸緩沖液、1.0ml 2%H2O2、 1.0ml 0.05mol/L 愈創(chuàng)木酚和0.1ml酶液。 以在沸水中加熱5min的酶液為對(duì) 照，做二組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系加入酶液 后，立即于37℃水浴中保溫15min，然后迅 速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入2.0ml 20%三氯乙 酸終止反應(yīng)。然后，過(guò)濾(或5000g 離心 10min),濾液適當(dāng)稀釋?zhuān)?51型分光光度 計(jì)在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
以每min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位 酶活力=——× D △A 0.01t 酶的比活力=——× D △A 0.01Wt 式中， △A為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為馬鈴 薯鮮重（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；D為稀釋倍數(shù)， 即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù) CAT過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法 過(guò)氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)又名 觸酶(Catalase，CAT)，是一類(lèi)以鐵卟琳為 輔基的結(jié)合酶，由4個(gè)亞基組成，分子量為 240 000。存在于動(dòng)植物組織與細(xì)胞中的氧 化還原酶類(lèi)，它專(zhuān)一性地將細(xì)胞代謝產(chǎn)生 的過(guò)氧化氫分解成H2O和02，避免了H202在體 內(nèi)積累，從而可維持體內(nèi)正常的活性氧水 平。是zui早發(fā)現(xiàn)的與種子活力有關(guān)的氧化 酶類(lèi)之一.
過(guò)氧化氫酶的應(yīng)用： 被用于食品包裝，防止食物被氧化。 在紡織工業(yè)中，被用于除去紡織物上的過(guò)氧化氫，以保證成品是不含 過(guò)氧化物的。 它還被用在隱形眼鏡的清潔上：眼鏡在含有過(guò)氧化氫的清潔劑中浸泡 后，使用前再用過(guò)氧化氫酶除去殘留的過(guò)氧化氫。
近年來(lái)，過(guò)氧化氫酶開(kāi)始使用在美容業(yè)中。一些面部護(hù)理中加入了該 酶和過(guò)氧化氫，目的是增加表皮上層的細(xì)胞氧量。 植物細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶體參與了光呼吸（利用氧氣并生成二氧化碳） 和共生性氮固定（將氮?dú)?N2）解離為活性氮原子）。細(xì)胞被病原體 感染時(shí)，過(guò)氧化氫可以被用作一種有效的抗微生物試劑。 其活性也與糧食品質(zhì)之間有一定的相關(guān)性，是一項(xiàng)衡量谷物品質(zhì)的 重要指標(biāo)。
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