實(shí)驗(yàn)方法原理 本試劑盒采用特殊的細(xì)胞裂解和蛋白去除液（包括蛋白酶K 裂解）從抗凝全血中得到基因組DNA。適用于從凍全血、血漿、血清、骨髓、其他體液、淋巴細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、病毒和線(xiàn)粒體中提取DNA。
實(shí)驗(yàn)材料 抗凝全血
試劑、試劑盒 血基因組DNA 試劑盒
儀器、耗材 96孔深孔板96圓孔板96孔DNA制備板96圓孔硅膠片BF-400膜
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
1. 說(shuō)明書(shū)，耗材：96孔深孔板（1.6 ml），96圓孔板，96孔DNA制備板，96圓孔硅膠片，BF-400膜。
2. Proteinase K：凍干的蛋白酶K 可室溫貯存6 個(gè)月，長(zhǎng)時(shí)間保存請(qǐng)置于4℃；溶解后，在2-8℃可貯存2 個(gè)月，長(zhǎng)時(shí)間保存請(qǐng)勿置于室溫中。
3. Buffer PK ：蛋白酶K 溶解液，室溫密閉貯存。
4. Buffer BL ：細(xì)胞裂解液，室溫密閉貯存。
5. Buffer W1B concentrate ：洗滌液。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?00%乙醇或95%乙醇。
6. Buffer W2 concentrate ：去鹽液。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?00%乙醇或95%乙醇。
7. 10×Buffer W2（12×96 試劑盒）：用于配制Buffer W2 。
8. Eluent B：7.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.3 mM EDTA ，室溫密閉貯存。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. *次使用時(shí)，在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。
2. Buffer W2（12×96 試劑盒）配制：在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10×Buffer W2，135 ml 去離子水和350 ml 乙醇，可用100%無(wú)水乙醇或95%乙醇。
3. 根據(jù)瓶上標(biāo)簽將蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中，請(qǐng)勿旋渦振蕩。
4. 準(zhǔn)備70℃溫浴。
5. 使用前檢查Buffer BL 是否有沉淀析出，若出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于70℃溫浴加熱至沉淀*溶解后再使用。
三、操作步驟
1. 向96 圓孔板的每孔中加入20 μl 蛋白酶K。
2. 加200 μl 抗凝全血到96 圓孔板中。
* 若全血樣品體積少于200 μl，用PBS 補(bǔ)充到200 μl。
* 若樣品為鳥(niǎo)類(lèi)血，樣品用量須低于10 μl。
* 若需得到RNA-free 的基因組DNA，在步驟3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。
3. 加200 μl Buffer BL ，注意不要打濕每孔的邊緣，用96 圓孔硅膠片密封各孔。
4. 用力混合30 s。
5. 3000 rpm 簡(jiǎn)短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內(nèi)。啟動(dòng)離心機(jī)，當(dāng)速度達(dá)到3000rpm后即停止。
6. 在培養(yǎng)箱或烘箱中70℃溫浴至少10 min。
7. 3 000 rpm 簡(jiǎn)短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內(nèi)。啟動(dòng)離心機(jī)，當(dāng)速度達(dá)到3 000rpm后即停止。
8. 取下96 圓孔硅膠片，每孔加入200 μl 乙醇（96-100%）。
9. 用96 圓孔硅膠片密封各孔，用力混勻混合15 s。3 000 rpm 簡(jiǎn)短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到圓孔板內(nèi)。啟動(dòng)離心機(jī)，當(dāng)速度達(dá)到3 000 rpm 后即停止。
10. 將96 孔DNA 板放到一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圓孔板上的96 圓孔硅膠片，將每孔中的溶液轉(zhuǎn)移至96 孔DNA 板 中，6 000 rpm 離心4 min。
11. 丟棄96 孔1.6 ml 深孔板的濾液，將96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入500 μl Buffer W1B，用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 離心4 min。
* 確認(rèn)在Buffer W1B concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。
12. 丟棄96 孔1.6 ml 深孔板的濾液，將96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入850 μl Buffer W2，用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm 離心4 min。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。
13. 棄濾液，將96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入400 μl Buffer W2， 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 離心4 min。
14. 將96孔DNA板放在一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板上，用BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm離心15 min。
15. 將96孔DNA板放在另一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入100-200 μl Eluent B 或去離子水，室溫靜置2 min，用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板，6 000 rpm 離心4min洗脫得到DNA。
收起
注意事項(xiàng)
1. Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水和生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢(xún)。
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