實(shí)驗(yàn)方法原理 血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、用樣量少和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可通過控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例聚合成孔徑大小不同的凝膠，用于蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分離、定性和定量分析。
根據(jù)凝膠形狀不同分為盤狀電泳和板狀電泳。盤狀電泳是在直立的玻璃管中，利用不連續(xù)的緩沖液pH值進(jìn)行電泳而命名，同時(shí)，樣品混合物分開形成的帶很窄，呈圓盤狀，因此圓盤電泳這個(gè)名字成了不連續(xù)性和盤狀的雙關(guān)語。不連續(xù)盤狀電泳具有很高分辨力，這是由于有三種效應(yīng)存在、濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。
1.濃縮效應(yīng)：
管中裝有三種不同的凝膠層，見附圖，上層為樣品膠，第二層為濃縮膠，這兩層均為大孔膠、其緩沖為Tris-HCL緩沖液pH值為6.7。第三層為分離膠，該層為小孔膠Tris-HCL緩沖液，pH8.9。在上下電泳槽中充分以Tris-*緩沖液，pH值為8.3。這樣造成凝膠孔徑、pH值、緩沖液的不連續(xù)性。在此條件下，HCL幾乎全部電離為Cl-，*有極少部分的分子解離成NH2CH2COO-，一般酸性蛋白質(zhì)也能解離而帶負(fù)電荷。當(dāng)電泳系統(tǒng)通電后，這三種負(fù)離子同向正極移動(dòng)。根據(jù)有效泳 動(dòng)率的大小，zui快的稱為離子或先行離子(這里指Cl-)，zui慢的稱為慢離子或隨后離子(這里是NH2CH2COO-)。電泳開始后，快離子在前，在它之后形成一離子濃度低的區(qū)域，即低導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電壓梯度成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)就有了較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動(dòng)。在快離子和慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立后，則在快離子和慢離子之間造成一個(gè)不斷向陽極移動(dòng)的界面，由于蛋白質(zhì)的有效泳動(dòng)率恰好位于快、慢離子之間，因此蛋白質(zhì)樣品被夾在當(dāng)中濃縮成一狹窄層，這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。
2.電荷效應(yīng)：
蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷 不同，因而泳動(dòng)率也不同，因此各種蛋白質(zhì)樣品按泳動(dòng)率快慢順序排列一個(gè)一個(gè)的圓盤區(qū)帶。在進(jìn)入分離膠時(shí)電荷效應(yīng)仍起作用。
3.分子篩效應(yīng)：
當(dāng)被濃縮的蛋白樣品從濃縮膠進(jìn)入分離膠時(shí)，pH值和凝膠孔徑突然改變，選擇分離膠的pH值8.9(電泳時(shí)實(shí)際測量是9.5)，使接近*的pka(9.7～9.8)，這樣慢離子解離度增大，因而其泳動(dòng)率也增加，此時(shí)慢離子泳動(dòng)率*蛋白質(zhì)的有效泳動(dòng)率，高電壓梯度不復(fù)存在。此時(shí)各種蛋白質(zhì)不僅由于其分子量或構(gòu)型不同，在一個(gè)均一的電壓梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠時(shí)所受摩擦力不同，受阻滯的程度不同，表現(xiàn)泳動(dòng)率不同而被分開。
試劑、試劑盒 分離膠緩沖液單體交聯(lián)劑濃縮膠緩沖液加速劑：催化劑電極緩沖液氨基黑染色液乙酸蔗糖
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑
1.分離膠緩沖液(pH8.9)：取Tris36.3克加入1NHC148ml，再加水到100ml。
2.單體交聯(lián)劑：取丙烯酰胺30g，N-N-亞甲基雙丙烯酰胺0.8g，加蒸餾水到100ml。
3.濃縮膠緩沖液(pH6.7)：取Tris5.98g加1NHC148ml，加蒸餾水到100ml。
4.加速劑：四甲基乙二胺。
5.催化劑：10%過硫酸銨，取AP1克加水到10ml。臨用前現(xiàn)配。
6.電極緩沖液(pH8.3)：稱取Tris6g，*28.9g溶解后加蒸餾水到100ml，用時(shí)稀釋到1000ml。
7.0.5%氨基黑染色液：取考馬斯蘭R-250 0.5g，7%冰乙酸10ml，溶解后加水100ml，混勻。
8.7%乙酸：取含量37%的乙酸19ml加水至100ml。
9.20%蔗糖100μl與0.025%溴酚蘭5μl組成樣品稀釋液。
二、凝膠柱的制備
1.取0.5×100cm的玻管，從另一端量取7cm、8cm兩處，分別用玻璃鉛筆劃線，起端管口用小塊玻璃紙包封好，插入橡皮墊，垂直立于試管架上。
2.取小燒杯2個(gè)，標(biāo)號，先按表配制分離膠，待分離膠聚合后再配濃縮膠。
注意抽除溶液中氣泡
3.取1號杯混勻溶液后，用滴管吸取加入上述玻璃管至刻度(離底端約7cm)再以玻璃管小心在膠液上覆以0.5cm厚度的水層，將此玻璃管垂直放在試管架上，約半小時(shí)以上，凝膠聚合完成后，用濾紙吸去覆蓋的水層，這是分離膠。按表配制濃縮膠，搖勻，用滴管吸此液加于上述凝膠層，至第二刻度(8cm處)。同樣覆蓋0.5cm厚水層，垂直放于試管架上。聚合后，用濾紙吸去水層，這是濃縮膠。
三、加樣
血清中加1/3體積50%甘油或20%蔗糖溶液，加入少量0.5%溴酚藍(lán)作追蹤劑，混勻，吸此樣品30～50μ加在濃縮膠上。沿管壁加入電極緩沖液，直至項(xiàng)端。
四、電泳
1.將制備好的凝膠柱分別插入電泳槽底部的小孔，凝膠管垂直在上槽和下槽中，做好標(biāo)記。加好上、下槽電極緩沖液(Tris-*)，插上電極，上負(fù)下正。
2.將電流調(diào)至3mA/管，電壓100～200V，當(dāng)溴酚藍(lán)追蹤劑接近管底時(shí)(約電泳30分至1小時(shí))，切斷電源，將凝膠管取出(緩沖液倒入回收杯)。
五、剝膠
取下凝膠管，用帶有10cm長針頭注射器，內(nèi)盛蒸餾水作潤滑劑，將針頭插入膠柱與管壁之間，邊注水邊旋轉(zhuǎn)玻璃管，直至膠柱與管壁分開，用洗耳球輕輕在一端加壓，使膠柱從玻璃管中慢慢滑出。
六、染色與脫色
從管中取出凝膠柱浸入0.5%～1%氨基黑染液中，一般染色約10～15分鐘，但有的蛋白質(zhì)需要更長時(shí)間。染色后用水沖去多余的染料，放入7%乙酸中脫色，直至余下黑色全部脫去為止。約30分鐘。
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