一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉(zhuǎn)錄)
不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在總rna的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂;取2ug進行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時，要用DNase I進行消化(因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑)。
二、DNAse I 消化樣品RNA 中的DNA
用DNase I 消化DNA
組份 加量
模板(RNA) 10ug
RNase Inhibitor 4ul
DNase I buffer 10ul
DNase I 10ul
DEPC處理H2O 至100ul
混勻，37℃ 90min
三、RNA瓊脂糖凝膠電泳
1.1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：
1) 稱取瓊脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS緩沖液和39.5ml的DEPC水，放微波爐里溶化。
2) 待冷卻到60攝氏度左右時，加入1ml甲醛，搖勻(避免產(chǎn)生氣泡)。倒入凝膠板上凝固30min。
2.取各個RNA樣品4?l，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2?l混勻，加入變性膠加樣孔中。
3.120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。
4.RNA電泳結(jié)果如下圖所示?？梢?8S和18S兩條明亮條帶，無DNA條帶污染。
實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）實驗流程
四.RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
反轉(zhuǎn)錄程序(以MBI的M-MLV為例)
組份 加量(20ul體系) 加量(40ul體系)
模板(RNA) 0.1~2.5ug(根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)調(diào)整) 3ug(根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)調(diào)整)
引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul
DEPC處理H2O 至12.5ul 至25ul
混勻，70℃ 5min，立即冰浴
5*buffer 4.0ul 8.0ul
dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul
RNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul
混勻，37℃ 5min
M-MLV 1.0ul 2.0ul
42℃ 60min ，70℃ 10min
反轉(zhuǎn)錄引物的選擇與Real-Time PCR引物設(shè)計的要求
1)隨機六聚體引物：
當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA*鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
2)Oligo(dT)：
是一種僅對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。特別適合檢測多個基因的表達，這樣可以節(jié)約反轉(zhuǎn)錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達、從極少量細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平。
3)特異性引物：
zui特異的反轉(zhuǎn)錄方法是用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，*條鏈的合成可由與mRNA3’端zui靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。
做 Real Time PCR時，用于SYBR Green I/Eva Green 法時的一對引物與一般PCR的引物，在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求：
① Tm=55-65℃
② GC=30-80%
③ PCR擴增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。
④ 引物的退火溫度要高，一般要在 60℃以上。
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至于設(shè)計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法zui關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不易。
五、cDNA與引物質(zhì)量檢測
取0.2ml薄壁PCR管，編號。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物濃度10uM) ，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管補加水至20ul。
組份 加量
2×PCRTaqMix 10ul
10uMPrimer FW 0.5ul
10uMPrimer RV 0.5ul
Template DNA 1ul
ddH2O 混勻至20ul
混勻，置于TP600PCR儀中。95℃ 5min;95℃15s，60℃35s ，40cycles;72℃ 5min;4℃ pause。
取擴增產(chǎn)物各8μl，DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)5μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察。
選擇特異性好，擴增效率高的引物作為實時熒光使用引物。
六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況：
由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調(diào)控研究中都會用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調(diào)控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。
七、定量 PCR檢測：
取0.2ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，對應(yīng)的cDNA各1ul。一管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25ul。
組份 加量
模板(cDNA)/ddH2O 1.0ul
10uM 引物F/R 0.5ul
2×qPCR Mix 12.5ul
ddH2O 11.0ul
混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預(yù)變性后，95℃15s→65℃35s(熒光檢測)，40cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴增設(shè)成一個溫度，只在擴增出現(xiàn)問題時才會考慮設(shè)梯度。
八、擴增曲線和溶解曲線
實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）實驗流程
實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）實驗流程
溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增。
一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期，其形狀是一條平滑的S型曲線。
如果在熒光背景信號階段出現(xiàn)很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì);
如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
如果引物二聚體存在則陰性對照會出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-Time PCR中很難避免;
若是陰性對照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結(jié)果不可用。
在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：
① 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計引物;
② 在做基因表達差異時容易出現(xiàn)DNA被擴增峰(只在引物跨內(nèi)含子時存在)，出現(xiàn)原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA;
③ 擴增非特異，這時要重新摸擴增條件或重新設(shè)計并驗證引物。
九、表達差異的計算方法
定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算起始模板的拷貝數(shù);相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異之間的表達差異。
2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。
在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進行定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理后表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000 拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀。
2-△△CT方法的推導(dǎo)(詳見實時定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達量)
補充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對樣品重新進行氯仿抽提，具體實驗流程如下：
消化后總體積10Oul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200ulDEPC水。
1. 向離心管中加入等體積氯仿(約300ul) ，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。4℃14000 rpm離心8min，取上清(約250ul)。
2. 加入1/10體積的NaAC(3M)(約25ul)和預(yù)冷的等體積異丙醇(約280ul)，-20℃放置20min。
3. 4℃14000 rpm離心15min，去上清，注意不要觸到沉淀。
4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm離心3min，去上清。
5. 瞬時離心，用200ul(或10ul)的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)(勿吸到管底的沉淀)。
6. 把離心管放置于超凈臺晾至約5-10 分鐘(勿*干燥，否則很難溶)。加入30~50μl的無RNase的水，靜止1min 后，振蕩30sec，瞬時離心。
7. 將提取的RNA立即進行下游實驗，或放-20℃保存。
