實驗方法原理 凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽"（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小，凝膠達(dá)濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。
實驗材料 Sephadex G-25葡聚糖凝膠G-25
試劑、試劑盒 磷酸鹽緩沖液*碘汞蒸餾水磺基水楊酸溶液
儀器、耗材 錐形瓶量筒層析柱比色磁盤試管皮頭滴管
實驗步驟
一、試劑與器材
1. Sephadex G-25。
2. 0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。
3. 奈氏（Nessler）試劑：于500 ml錐形瓶內(nèi)加入*150 g，碘110 g，汞150 g及蒸餾水100 ml。用力振蕩7～15 min，至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩，直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的*汞液為止。將上清液傾入2000 ml量筒內(nèi)，加蒸餾水至2000 ml，混勻備用。
4. 20%（W/V）磺基水楊酸溶液。
5. 1.5cm×20 cm層析柱。
6. 黑、白比色磁盤。
二、操作
1. 取層析柱1支（1.5 cm×20 cm），垂直固定在支架上，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17 cm左右，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。
2. 凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5 ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。
3. 在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液。
4. 由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為“脫鹽"后的IgG。
注意：在檢測時，用皮頭滴管吸取管中溶液后應(yīng)及時洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。
實驗材料 蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒 膠母液磷酸氫氧化鈉三氯乙酸磺基水楊酸冰醋酸考馬斯亮藍(lán)
儀器、耗材 高壓電泳儀IEF槽離心機(jī)
實驗步驟
一、樣品提取
1. 1 ml 原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀。
2. 沉淀用100 μl IEF樣品緩沖液裂解，離心取上清。
二、制膠
1. 安裝超薄膠裝置
2. 依次加入下述試劑
（1）膠母液 2 ml
（2）尿素 8 M/脫氣
（3）NP-40 0.2 ml
（4）兩性電解質(zhì) 2 ml
（5）10%過硫酸胺 50 ul
（6）TEMED 5 ul
3. 倒膠
三、電泳
1. 預(yù)電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求：電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無氣泡）。
2. 將分別被陰陽極緩沖液浸潤的電極條置于膠面上將與陰陽電極接觸的部位 ，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200 V 預(yù)電泳10 min。
3. 電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預(yù)備點樣的膠面上，取10~15 ul 樣品液，點于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進(jìn)行電泳
4. 電泳參數(shù)：200 V，30 min；400 V，30 min；800 V，4 hr。
四、染色
1. 固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10 min。
2. 顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現(xiàn)。
