實(shí)驗(yàn)方法原理
蔗糖酶( inver tase ) (β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶) ( fructofuranosidefructohydrolase ) ( EC. 3 . 2 . 1 . 26 ) 特異地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵水解, 具有相對(duì)專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖, 也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。
啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶, 通過研磨破細(xì)胞壁, 使酶游離出來, 用水萃取酶, 然后用有機(jī)溶劑沉淀酶蛋白得到粗制品,還可用柱層析進(jìn)一步純化得到精制品。
實(shí)驗(yàn)材料 啤酒酵母
試劑、試劑盒 二氧化硅去離子水冰塊食鹽乙酸乙醇
儀器、耗材 研缽離心管滴管量筒恒溫水浴鍋燒杯pH試紙高速冷凍離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 提取
（1）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴, 將研缽穩(wěn)妥地放入冰浴中。
（2）稱取10 g 濕啤酒酵母, 和適量( 約5 g) 二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預(yù)先研細(xì)。
（3）緩慢加入預(yù)冷的30 ml 去離子水, 每次加2 ml 左右, 邊加邊研磨, 至少用30 分鐘。至酵母細(xì)胞大部分研碎, 以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。
（4）(可選項(xiàng)) 研磨時(shí)用顯微鏡檢查研磨的效果。
（5）將混合物轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心管中, 平衡后, 用高速冷凍離心機(jī)離心, 4 ℃ , 10 000 r/ min , 離心15 min。
（6）用滴管小心地取出水相, 轉(zhuǎn)入另一個(gè)清潔的離心管中,4 ℃ , 10 000 r/ min , 離心15 min。
（7）將上清液轉(zhuǎn)入量筒, 量出體積。用廣泛pH 試紙檢查上清液pH, 用1 mol/ L 乙酸將pH 調(diào)至5 . 0 , 稱為“ 級(jí)分I"。留出1.5 ml 測(cè)定酶活力及蛋白含量, 剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。
2. 熱處理和乙醇沉淀
（1）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到50 ℃ , 將盛有級(jí)分Ⅰ 的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中, 50 ℃下保溫30 分鐘, 在保溫過程中不斷輕搖離心管。
（2）取出離心管, 于冰浴中迅速冷卻, 4 ℃ , 10 000 r/ min ,離心10 min。
（3）將上清液轉(zhuǎn)入小燒杯中, 放入冰鹽浴( 沒有水的碎冰撒入少量食鹽) , 緩慢地加入等體積預(yù)冷至- 20 ℃的95%乙醇, 同時(shí)輕輕攪拌, 再在冰鹽浴中放置10 分鐘, 以沉淀*。于4 ℃ ,10 000 r/ min , 離心10 min , 傾去上清液, 并滴干, 沉淀保存于離心管中, 蓋上蓋子或薄膜封口, 然后將其放入冰箱中冷凍保存(稱為“級(jí)分Ⅱ")。
廢棄上清液之前, 要用*檢查其酶活性( 與下一個(gè)實(shí)驗(yàn)一起做)。
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