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技術(shù)文章

DNA作圖實(shí)驗(yàn)

閱讀：242發(fā)布時(shí)間：2015-6-10

多種酶消化
實(shí)驗(yàn)材料    DNA
試劑、試劑盒    限制酶緩沖液
儀器、耗材    電泳儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  用低頻率切割的不同限制性內(nèi)切酶分別*消化DNA。
 
2.  從每個(gè)反應(yīng)取小份樣品作電泳分析，用已知的分子量標(biāo)準(zhǔn)作對照。剩余的樣品置于冰浴。
 
3.  比較分子量標(biāo)準(zhǔn)估算出DNA片段的長度，推導(dǎo)出每種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)數(shù)目。
 
4.  從1的每個(gè)樣品管中取少許置另外的管中，用第二種內(nèi)切酶消化，電泳分析比較酶切結(jié)果。

（1）兩種酶切割。

（2）*種酶單獨(dú)切割。

（3）第二種酶單獨(dú)切割。

5.  估算DNA片段的長度，重復(fù)此步驟，直到明確一致而且相互不矛盾的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)被推導(dǎo)出來，DNA圖譜便告完成。

限制酶部分消化

實(shí)驗(yàn)材料    DNA
試劑、試劑盒    限制酶緩沖液
儀器、耗材    電泳儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  用低頻率切割的不同限制性內(nèi)切酶分別*消化DNA。

2.  用32P末端標(biāo)記消化產(chǎn)物，5’末端可先用小牛腸堿性磷酸酶處理。

3.  用T4多核苷酸激酶進(jìn)行標(biāo)記。

4.  3’末端可先用大腸捍菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或T4 DNA聚合酶來標(biāo)記。
 
5.  用第二種內(nèi)切酶消化DNA片段，通過凝膠電泳分離產(chǎn)物，純化那些僅單末端帶放射性標(biāo)記的DNA片段。
 
6.  用系列稀釋酶法以相對高頻度切割的限制酶部分消化分離的DNA片段，電泳分離片段并進(jìn)行自顯影曝光。

7.  用放射性標(biāo)記的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，估算出片段的長度。


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