實驗材料 RNA
試劑、試劑盒 T4多核苷酸激酶dATP醋酸鈉乙醇EDTARNaseA*氯仿
儀器、耗材 恒溫培養(yǎng)箱NAP-5柱-70°C冰箱低溫離心機(jī)
實驗步驟
1. 依次加入下列試劑，建立用以標(biāo)記引物的反應(yīng)混合液（終體積10 μl）
（1）2.5 μl H2O
（2）1 μl 10×T4多核苷酸激酶緩沖液
（3）1 μl 0.1 mol/l DTT
（4）1 μl 1 mol/l 亞精胺
（5）1 μl 50~100 ng/μl 掛核苷酸引物
（6）3 μl 10 μCi/μl［γ-32P］ATP
（7）0.5 μl 20~30 U/μl T4多核苷酸激酶
（8）37℃溫育1 h。
2. 加入2 μl 0.5 mol/l EDTA和50 μl TE緩沖液終止反應(yīng)，于65℃溫育5 min。
3. 用硅化過的1 000 μl 吸頭塞上玻璃棉作成一小離子交換拄，加入20 μl AG 50W-X8樹脂和100 μl DE-52樹脂，以1 ml TEN緩沖液洗柱。
4. 將步驟2的標(biāo)記反應(yīng)物加入柱子，收集流出液重復(fù)上柱。
5. 用1 ml，TEN100緩沖液洗柱，然后以0.5 ml TEN300洗，棄洗脫液。
6. 以0.4 ml TEN600緩沖液洗脫標(biāo)記寡核苷酸引物，收集流出液，在有合適屏蔽的容器中保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
7. 取RNA樣品在微量離心管中將下列物質(zhì)混合（終體積15 μl）：
（1）10 μl 細(xì)胞總RNA
（2）1.5 μl 10×雜交液
（3）3.5 μl 放射性標(biāo)記寡核苷酸
（4）確保微量離心管密封，并將其淹沒在65 ℃水洛中90 min，取出在空溫中慢慢冷卻。
8. 在冰浴的微量離心管中加入以下延伸反應(yīng)混合液（終體積每個RNA樣品30.33 μl）：
（1）0.9 μl 1mol/l Tris·Cl緩沖液，pH8.3
（2）0.9 μl 0.5 mol/l MgCl2
（3）0.25 μl 1 mol/l DTT
（4）6.75 μl 1 mg/ml *
（5）1.33 μl 5 mmol/l 4dNTP混合液
（6）20 μl H2O
（7）0.2 μl 25 U/μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶
9. 在含有RNA及寡核苷酸的微量離心管中，加入30 μl 上述延伸反應(yīng)混合物，42℃溫育1 h。
10. 在毎個微量離心管中加入105 μl RNA酶反應(yīng)混合物，于37 ℃育15 min。
11. 加入15 μl 3 mol/l 乙酸鈉和150 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提，將上層水相移入一個干凈管子中，再加入300 μl 乙醇沉淀DNA，沉淀物以100 μl 70%乙醇洗滌，用吸管吸去微量的乙醇?xì)堄?，沉淀晾?~10 min。
12. 用5 μl 終止/加樣染料液重溶沉淀，65℃水浴加熱5 min，在9%丙烯酰胺/7 mol/l 尿素凝膠中電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部。
13. 干燥凝膠并用增感屏放射自顯影。
