實(shí)驗(yàn)材料 包裝細(xì)胞系
試劑、試劑盒 HEPESCaCl2甘油DMSO
儀器、耗材 培養(yǎng)皿培養(yǎng)板離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 在轉(zhuǎn)染前1天，在10 cm 培養(yǎng)皿中接種包裝細(xì)胞，接種密度大約相當(dāng)于10%~20%片的細(xì)胞數(shù)。
2. 將10 μg 含有藥物抗性基因的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA加入0.5 ml HeBS。再加入32 μl 2 mol/l CaCl2并同時(shí)輕輕搖晃。用手指輕彈試管外壁約 30 s，然后在室溫下溫育45 min，直到形成細(xì)小的淡藍(lán)色沉淀。
3. 移去包裝細(xì)胞的培養(yǎng)液，吸取HeBS-DNA沉淀輕輕加在培養(yǎng)皿的*。在組織培養(yǎng)操作櫥內(nèi)讓細(xì)胞接觸DNA 20 min，大約10 min 后，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿以均勻分散DNA溶液，加10 ml 培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于37℃溫育4 h。
4. 吸盡培養(yǎng)液，輕輕加入2.5 ml 室溫的HeBS/甘油溶液。將培養(yǎng)血放回培養(yǎng)箱中溫育3.5 min 或90 s，或?qū)τ谔囟?xì)胞經(jīng)測定的合適的溫育時(shí)間?？焖贄壋鼿eBs/甘油溶液，細(xì)胞用10 ml 培養(yǎng)液輕輕清冼， 重復(fù)用培養(yǎng)液清洗1次，加5 ml 含有血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)18~24 h。
5. 移出培養(yǎng)液，用0.45 μm的濾器過濾，獲得的上清含有短暫產(chǎn)生的病毒；將其貯存于 -70℃或-80℃，或者立即用于感染另一個(gè)帶有不同類別的包膜基因的包裝細(xì)胞系， 以產(chǎn)生一個(gè)被感染的產(chǎn)生病毒的細(xì)胞系。
6. 在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中加10 ml 培養(yǎng)液，培養(yǎng)2~3天，然后繼續(xù)步驟10。
7. 在感染前1天，將包裝細(xì)胞系按1：10至1：20傳代。
8. 移去將要感染的包裝細(xì)胞系的培養(yǎng)液。加病毒如下：用于感染一個(gè)10 cm 的培養(yǎng)皿上的細(xì)胞，稀釋0.1~1.0 ml 毒原液至終體積3~5 ml 并加800 μg/ml 的polybrene至8 μg/ml；如感染一個(gè)6 cm 的培養(yǎng)皿，稀釋0.1~1 ml 病毒原液至終體積2 ml，并加800μg/ml 的polybrene至終濃度8 μg/ml 溫育1 h。
9. 對(duì)于10 cm 培養(yǎng)皿則，加培養(yǎng)至終體積10 ml，對(duì)于6 cm 培養(yǎng)皿則加4 ml。培養(yǎng)2~3天。
10. 在轉(zhuǎn)染或感染后2~3夭，將轉(zhuǎn)染的或惑染的細(xì)胞按1：10或1：20傳代， 加選擇培養(yǎng)液，培養(yǎng)3天。換新的選擇培養(yǎng)液，再培養(yǎng)4~7天直至可見到細(xì)胞克隆。
11. 用克隆圓柱體挑取分隔良好的細(xì)胞克隆，每個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至2個(gè)24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中。生長至50%~90%匯片。
12. 移去培養(yǎng)液，換成1/2體積的培養(yǎng)液。視包裝細(xì)胞系不同而培養(yǎng)1~3天，移出培養(yǎng)液，立即對(duì)其進(jìn)行直接滴定，或貯存于-70℃或-80℃。
13. 繼續(xù)傳代各產(chǎn)病毒細(xì)胞克隆，直至其可凍存，和（或）直至鑒別出的產(chǎn)病毒細(xì)胞。當(dāng)鑒定出一個(gè)好的產(chǎn)病毒細(xì)胞克隆時(shí)，細(xì)胞分裝在20~25支凍存管（1~2 ml 每支） 中，培養(yǎng)液含10%~50%DMSO，在液氮中凍存。
收起
注意事項(xiàng)
1. 如果轉(zhuǎn)染的目的是為了生成穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細(xì)胞系，有兩種選擇。*種選擇是從那些已經(jīng)穩(wěn)定整合了載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中進(jìn)行選擇。這些細(xì)胞可置于藥物選擇之下，對(duì)產(chǎn)生的藥物抗性細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)毒篩選。第二種選擇是用“交叉感染"的包裝細(xì)胞系。上述第5步中收集到的短暫產(chǎn)生的病毒可用來感染另一個(gè)包裝細(xì)胞系，如步驟7~9。其后被感染的包裝細(xì)胞可置于藥物選擇之下。無論用哪種方法，目的都是為了分離穩(wěn)定整合了病毒基因組并產(chǎn)生可能的zui高滴度的包裝細(xì)胞。
2. 這個(gè)方法較用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞方法可能更受次迎，因?yàn)橛筛腥径a(chǎn)生的前病毒常常是與宿主基因組穩(wěn)定地并在整合后不發(fā)生重排或丟失。用這種方法時(shí)必須用表達(dá)不同類別的病毒糖蛋白的兩種包裝細(xì)胞系，當(dāng)一個(gè)包裝細(xì)胞系產(chǎn)生一種持定的env搪蛋白時(shí)，該包裝細(xì)胞的表面的受體就被那種病毒糖蛋白結(jié)合而被阻斷。當(dāng)用交叉感染時(shí)，兩種包裝細(xì)胞系必須是同源的。
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