摘要： 目前,感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法制備,即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時(shí)處理快速生長(zhǎng)的細(xì)菌,從而獲得感受態(tài)細(xì)菌.本方法的關(guān)鍵是選用的細(xì)菌必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,實(shí)驗(yàn)操作必須在低溫下進(jìn)行.
原理：
目前, 感受態(tài)細(xì)胞 的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2處理 細(xì)菌 的方法制備,即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時(shí)處理快速生長(zhǎng)的細(xì)菌,從而獲得感受態(tài)細(xì)菌.此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形,外源 DNA 分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在 細(xì)菌 表面,通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收.轉(zhuǎn)化效率可達(dá)106-107轉(zhuǎn)化子/微克DNA.
本方法的關(guān)鍵是選用的細(xì)菌必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,實(shí)驗(yàn)操作必須在低溫下進(jìn)行.
操作：
1、取-70℃冰凍菌種,用劃線法接種細(xì)菌于培養(yǎng)皿,做好標(biāo)記,于37℃培養(yǎng)過夜.
2、第二天,從平板上挑取單個(gè)菌落,接種至含有3ml LB培養(yǎng)液的試管中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜.次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養(yǎng)基的500ml燒瓶中,37℃劇烈震蕩培養(yǎng)約2~3小時(shí)（200~300r/min）
3、當(dāng)菌落600nm OD值達(dá)到0.3-0.4時(shí),將燒瓶取出放置冰上10~15分鐘.在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中.4℃,4000g離心10分鐘.
4、棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養(yǎng)液.加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中,振蕩混勻,懸浮菌體,冰浴30分鐘.
5、4℃,4000g離心10分鐘,棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養(yǎng)液.加4ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2,重懸浮菌體.每管0.2ml分裝,至4℃保存?zhèn)溆?24-48小時(shí)內(nèi)使用效果較好.如果暫時(shí)不用,可再保存于-70℃的低溫冰箱中.
會(huì)員1.png)