石蠟切片制作步驟，一、試劑配法
1．中性甲醛固定液：
甲醛（37%-40%，市售，本所購買即為此濃度） 100mL
* 6.5
磷酸二氫鉀（鈉） 4g
雙蒸水 900mL
2．蘇木精、伊紅染色液為碧云天產(chǎn)品
3．1%鹽酸乙醇液
鹽酸 1份
70%酒精 100份
4．甘油蛋白貼片劑：
蛋白 50 ml
甘油 50 ml
*（防腐劑） 1g
配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。zui后加入防腐劑（*）作防腐用?？杀４鎺讉€月。
石蠟切片制作步驟，二、實驗步驟
1．取材
頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。
切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2－3mm厚。
注意事項：
（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構等發(fā)生變化。
（2）切片材料應根據(jù)需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。
2．固定
將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入中性福爾馬林固定液中固定，固定30－50min。
注意事項：
（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。
（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1-2次新液。
（4）材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，并隨同材在溶液中投入相應的標簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字，應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。
3. 洗滌
材料經(jīng)固定后,流水沖洗，數(shù)小時。
4. 脫水
材料依次經(jīng)70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。各
注意事項：
（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。
（2）在更換高一級的脫水劑時，不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。
（3）在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。
（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。
（5）如需在70%酒精中。
（6）脫水必須*，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象
5．透明
純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明為止）。
由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。
透明注意事項
（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。
（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。
（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應退回純酒精中重新脫水，然后再透明。
6．透蠟
放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘。
透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織大小而定。透蠟應在恒溫箱內(nèi)進行，并保持箱內(nèi)溫度在55-60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5h。
石蠟切片制作步驟，透蠟注意事項
（1）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；
（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，力求在zui短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。
7. 包埋
包埋時，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質(zhì)地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟模中，排列整齊。再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。
8. 切片
（1）將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。
（2）將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。
（3）搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。
（4）調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。
（5）調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4-10微米。
（6）一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-50r/min。
（7）切成的蠟帶到20-30cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。
（8）用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。
（9）切片工作結(jié)束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。
9. 展片、貼片
打開水浴鍋，使水溫維持在40-45℃，另準備30%乙醇溶液。
（1） 切片時，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。
（2） 用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。
（3）小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。
（4） 另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標記或貼上標簽，放于切片架上。
10. 脫蠟復水
將水浴鍋溫度調(diào)至60℃，待水溫控制在60℃時，將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30min至蠟熔化。
之后，石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。
11． 染色
切片放入蘇木精中染色約10-30min。
染色時間應根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。
12．水洗
用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可），但要注意流水不能過大，以防切片脫落。
13．分化
將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數(shù)十秒鐘。見切片變紅，顏色較淺即可。
14．漂洗
切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。
15．脫水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。
16、復染
用0.5%伊紅乙醇液對比染色1-3min。
伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。
17．脫水Ⅱ
將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min。zui后用吸水紙吸干多余的乙醇。
18．透明
切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。
二甲苯應盡量保持無水，應經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。
19．封藏：中性樹膠封存
因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。
，封藏的方法：
封片前應根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的*滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。
染色結(jié)果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。
